氨基酸发酵机制及过程.ppt

（5）其它遗传标记 选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。 3.选育能提高谷氨酸通透性的菌株 （1）选育生物素缺陷型菌株。 （2）选育油酸缺陷型菌株。 （3）选育甘油缺陷型菌株。 （4）选育温度敏感型突变株 突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。 另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨酸。 (5)其它突变型菌株 抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增强谷氨酸的通透性。 五、基因工程选育 基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。 载体系统 ：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为多。 受体系统 ：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。 供体菌株：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异株。 工具酶：切割供体DNA和载体DNA的工具酶——限制性内切核酸酶有许多种，HindⅢ、Bcl I、Xba I和Xam I效果最好。 载体系统 受体系统 供体菌株 工具酶 谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因已被克隆，Ozaki等克隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了50％。 周盛等从大肠杆菌E.coli k-12中通过PCR克隆出磷酸果糖激酶编码基因(pfkA)，将其连到表达载体，连接构建成重组质粒pKu-1，转化谷氨酸棒杆菌B4，并得到表达；酶活性测定表明pf-kA基因表达活力为128.6±o.86u／g的蛋白。同时，转化子菌株对糖转化率比B4高10.64％，产酸率比B4高17.1％。 以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低，高浓度的醋酸易被完全氧化。 当菌体内的有机酸浓度低到一定程度，DCA循环启动，此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶，TCA循环转为DCA循环，不利于谷氨酸生成与积累； 当DCA循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩时，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转。 (2)以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响 4．CO2固定反应的调节 CO2固定反应主要通过以下途径完成： C02的固定反应的作用：补充草酰乙酸； 在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与C02固定的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。 5．NH4+的调节 谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应，脱氨过程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧化成NAD+，同时产生的NH3很容易被除去。 脱氨反应被NH4+和α-–酮戊二酸所抑制，这对于谷氨酸的积累也起到了很好的作用。 在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌在NH4+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高； NH4+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是α-–酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨酸。 四、细胞膜通透性的调节 对谷氨酸发酵的重要性：当细胞膜转变为有利于谷氨酸向膜外渗透的方式，谷氨酸才能不断地排出细胞外，这样既有利于细胞内谷氨酸合成反应的优先性、连续性，也有利于谷氨酸在胞外的积累。 细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的半渗透性膜，磷脂双分子层为其基本结构，在双分子层中镶嵌蛋白质。 一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜； 一种是通过干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。在膜内外渗透压差等因素影响下，细胞膜物理性损伤，增大膜的通透性。 根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜通透性的方法主要有两种： 1．控制细胞膜的形成 ①利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制发酵培养基中生物素的浓度。 生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了磷脂的合成和细胞膜的形成。 生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，对脂肪酸的形成起促进作用。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量控制生物素添加，抑制不饱和脂肪酸的合成，使得细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。 ②利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或饱和脂肪酸。 在生物素过量的条件下，添加表