烟草坏死病毒A诱导的基因沉默与其条件优化.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 201 1, 38(10): 919~928 草坏死病毒 诱导的基因沉默及其条件优化* A 高阳 张永亮 张晓峰 韩成贵 于嘉林 李大伟** ( 国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100 193) C 摘要 以烟草坏死病毒A 中国分离物(Tobacco necros is v irus A Chinese isolate, TNV-A )侵染性cDNA 克隆为基础，通过基因 替换、基因插入策略构建获得多种重组TNV-AC，比较了外源基因片段插入位置、插入形式及接种植物培养温度对TNV-AC 诱导的基因沉默的影响 外源基因片段替换CP 基因 19～828 nt 的重组TNV-AC 丧失了在本生烟 的系统移动能力，也不能 有效诱导相应基因发生明显的沉默，说 替换策略不适合于TNV-AC 向CP 基因终止密码子UAG 附近插入外源基因片段 后，TNV-AC 仍可进行复制，但最适的插入位点位于UAG 之后，且容纳外源片段的长度约为120 nt 当外源片段以反向重复 的形式插入UAG 之后，诱导基因沉默的效率较高 接种植物的培养温度也会显著影响基因沉默的效率以及插入片段的稳定 性，低温(18℃)条件下诱导NbPDS 基因沉默的效率 显高于高温(24℃)条件，且沉默表型可持续 110 天以上 除了本生烟 基因，TNV-AC 沉默载体还可诱导本生烟sulfur 基因 和镁离子螯合酶H 亚基基因 发生沉默，以上结果说 ， PDS Su ChlH TNV-AC 具有开发为本生烟基因功能鉴定的新VIGS 载体的潜力 关键词 烟草坏死病毒A，病毒诱导的基因沉默，条件优化 学科分类号 Q939.46 DOI: 10.3724/SP.J.1206.201 1.00 129 病毒诱导 的基因沉默(virus-induced gene 不影响病毒基因组二级结构的情况下，将外源的植 silencing, VIGS)是近年来发展起来的一种快速鉴定 物基因片段插入病毒的 2 个开放阅读框(open 植物基因功能的反向遗 学工具，其原理是，携带 reading frame ，ORF)之间，或者置于病毒的亚基因 目的基因片段的重组病毒侵染植物后，由于同源抑 组(subgenome)启动子之后[10] 对于基因组相对较小 制诱导相应的植物内源基因发生沉默，从而根据表 的卫星DNA 分子，则可以将目的片段插入两个重 型的变化分析目的基因的功能[1-2] 基于RNA 沉默 复的卫星DNA 分子之间[11] 原理的VIGS 技术，在未获得基因全长的情况下， VIGS 载体 外源基因片段插入的方式有：正 通过插入EST 序列、候选基因的片段或者cDNA 向插入、反向插入、反向重复(inverted repeats，IR) 文库即可鉴定目的基因的功能 此外，通过VIGS 插入和发夹状结构(hairpin)插入等形式 理 上， 技术可在数周之内获取相应基因的表型，无需构建 含有长度仅为23 nt 插入片段的VIGS 载体就可诱 [12] 超表达或者RNAi 转基因植株 目前，VIGS 已在 导目的基因的沉默 ，但在实际应用中，通常需要 [3-4] [5-6] [7-8]