ELISA综合性实验.ppt

ELISA综合性实验一 ELISA检测全过程 包被 封闭 最佳工作浓度的确立 检测预实验 正实验 封闭blocking 包被后固相载体表面会留有少量未被吸附的空位点，反应过程中加入的待检标本或酶标抗体等可能与之产生非特异性吸附，导致检测本底偏高。为避免之，包被后再用1%-5%BSA或5%-20%小牛血清包被一次消除干扰，此过程称为封闭。 最佳工作浓度的选择(实验指导p.31) 综合性实验设计方案探讨 ——此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300μl (经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩小为10μg/mL ～ 60μg/mL)。 ——包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml ——酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml ——1:50酶标抗体液每组100μl（预实验后工作浓度范围缩小在1:2000～1:10000之内） ——800μg/mL的检测抗原原液每组800μl（自己调整检测浓度，此次试验强阳性抗原为400μg/mL、弱阳性抗原浓度为20μg/mL、阴性直接加抗原稀释液 ） ——聚苯乙烯酶标板条3条，共36孔 实验设计操作 包被抗体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立； 用包被液稀释抗体，充分混匀10-15分钟； 聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100μL，4℃包被48h。 弃去孔内液体，每孔加200μL封闭液，4℃封闭24h。 弃去封闭液，风干，检测（检测时每孔所加的各稀释度的酶标液和抗原都为100μL ），结果分析。 实验设计要求 在实验本上绘出36孔设计图表 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 写出最终测得的OD值并分析实验结果。 ELISA手工检测HbsAg影响因素探讨实验 ELISA手工检测的影响因素 边缘效应 叠加效应 温浴方式 加样方式 洗涤液的量和洗涤次数 试剂温度和质量 温浴的温度和时间 实验设计 第一组：边缘效应 第二组：叠加效应 第三组：温浴方式 第四组：加样方式 第五组：洗涤次数 第六组：温浴时间 第七组：试剂温度 小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性，讲述时间为3分钟左右。 要求设计方案中包括： 实验对象、标本要求 操作条件、操作过程（可画出96孔加样示意图或对比示意图等） 结果判断标准 结果分析方式 谢谢！ * * — 与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。 — 将抗原或抗体的固相化的过程称为包被。 — 最常用的包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。 包被coating 参考选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右,阴性参考血清A值0.1 （即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标浓度为最佳的ELISA检测浓度。） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ABCDEFGH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 96孔酶标板 可拆卸酶标条