肾癌786-O细胞HIF-1α的表达机制和意义.pdf

肾癌786-O 细胞HIF-1α的表达机制及意义1 车乐，龚侃，那彦群 北京大学第一医院泌尿外科，北京大学泌尿研究所，北京（100034 ） E-mail ：gongkan 2004@ 摘 要：目的 探讨肾透明细胞癌786-O 细胞在缺氧条件下缺氧诱导因子 1α （HIF-1α）的 表达变化及意义。 方法 免疫组化法分析 20 例肾细胞癌 HIF-1α表达情况；786-O 细胞在缺 氧条件下不同时间（0 、8、16、24 小时）培养后，RT-PCR 法检测 HIF-1αmRNA 的转录情 况；Western Blot 法检测 HIF-1α蛋白表达变化。 结果 免疫组化示 HIF-1α在肾癌细胞核 主要表达,在肾正常组织中 HIF-1α无表达；常氧状态下 HIF-1αmRNA 和蛋白均有一定表达。 在缺氧处理一段时间后（8、16、24 小时）786-O 细胞 HIF-1αmRNA 表达没有明显改变 （p0.05 ）；HIF-1α蛋白水平表达显著升高（p0.01 ）。缺氧 24 小时蛋白表达较前一时间略 下降。 结论 HIF-1α与肾细胞癌密切相关。在缺氧条件下 786-O 细胞HIF-1α表达变化主 要在翻译水平而非转录水平。对蛋白水平的调控是以 HIF-1α 为目标的肾透明细胞癌治疗靶 点。 关键词：缺氧诱导因子-1α，缺氧，肾透明细胞癌 中图分类号:R737.11 1. 引言 缺氧是恶性肿瘤生长过程中普遍存在的现象，随着肿瘤不断增大，肿瘤内部不能得到足 够的血液供应，导致局部的缺血乏氧状态；而肿瘤细胞发生厌氧代谢的适应性变化,促进肿 瘤生长。有研究表明[1]，肿瘤细胞通过HIF-1 提高对缺氧的耐受，增加肿瘤自身的血氧供应， 从而满足肿瘤快速生长的需要。本研究采用本研究采用免疫组化法检测肾癌组织HIF-1α表 达情况；RT-PCR 、蛋白免疫印迹法分别检测肾透明细胞癌786-O 细胞在不同缺氧时间下其 HIF-1α在分子和蛋白水平的表达，以探讨缺氧诱导因子对肾透明细胞癌生物学行为的影响， 为以HIF-1α为靶点的治疗提供理论依据。 2. 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 20 例肾细胞癌标本均来自我院2005 年 10 月至2006 年8 月手术治疗的肾细胞癌患 者。其中男13 例,女7 例;年龄36～68 岁,平均51.5 岁。所有患者术前均未接受放疗、化疗及 免疫治疗。10 例癌旁正常肾组织(远离肿瘤边缘5 cm)作为对照,并经病理切片证实。 肾透 明细胞癌细胞株786-O 由北大人民医院惠赠。（786-O 细胞为国际公认肾透明细胞癌标准细 胞） 2.1.2 主要试剂及设备 胎牛血清购自美国Hyclone 公司；TaqDNA 聚合酶购自上海Sangon 生物制品公司；细胞总RNA 提取试剂Trizol 购自美国GIBCO 公司；一抗购自Sigma 公司， 二抗购自北京中山生物技术有限公司；细胞培养细胞培养箱为HERAEUS 公司产品。 2.2 方法 2.2.1 免疫组化 采用LSAB 免疫组化染色法,操作按药盒说明书。 2.2.2 细胞培养及低氧处理 786-O 细胞在正常条件下培养，细胞培养贴壁率在40∼50%后， 1本课题得到高等学校博士点专项科研基金(20040001113)的全额资助。 -1- 置于低氧环境培养，分不同时间段（8、16、24h ）对786-O 细胞进行相应指标观察。低氧环 境的建立：细胞培养瓶置于密闭容器中，于入气孔持续通入95%N 和5%CO 混合气体，气 2 2 体从容器的另一孔排除，10min 后封闭容器，置37℃培养箱继续培养。 2.2.3 Western Blot 检测 取 786-O 细胞加三去污[50mmol/Tris-Cl （Ph7.5 ）