聚丙烯酰胺凝胶电泳前活性染料及蛋白质共价染色的条件探索.pdf

第38卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第10期 2010年10月 ChineseJoumMofAnalyticalChemistry 1423—1427 DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01423 聚丙烯酰胺凝胶电泳前活性染料与蛋白质共价染色的条件探索 戴彬1 吉坤美2 张同艳1 彭孝军“ 1(大连理工大学精细化工国家重点实验室，大连116012)2(深圳大学医学院，深圳518960) 摘要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳前染色法，考察了多种类型活性染料与牛血清白蛋白共价染色的条件。实 验发现，活性蓝KN·R型标记效果最佳，其优化标记条件为：pH10．0，60℃，50min，蛋白检出限达200 ng，重 复性和测试范围内的定量性较好，可在电泳时直接实时观测，作为蛋白标示剂有一定的应用前景。 关键词聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白染色；活性染料 1 引 言 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法对蛋白质等样品进行分离¨J，一般需要对分离样品进行染色， 以检验分离效果，这主要是利用染料和生物大分子(如蛋白质等)结合生成有色的复合物来实现检测的 目的。目前，比较常见的染色方法有后染色法和前染色法。后染色法是在电泳之后进行蛋白质染色的 方法，考马斯亮蓝染色和银染法就是最为常见的两种蛋白电泳后染色法【2J。人们尝试用荧光染料对凝 胶中的蛋白质条带进行染色旧，4J，但这种方法需要在uV瞬变显示器或紫外灯下观测，不能实时观察分 离过程。后染色法需要在电泳之后再进行一步染色操作，耗时。前染色法，即预染色法，是在电泳前对 蛋白质染色的一种方法。前染色法操作简单方便，而且可在电泳同时实时观察蛋白质的电泳分离带。 本研究比较了几组商品化活性染料的蛋白质染色条件，可用肉眼直接观测分离过程。活性染料廉价易 得，对用作蛋白标示剂p·具有一定的意义。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 全自动数码凝胶图像处理系统。 购自泰兴市锦鸡染料有限公司。 牛血清白蛋白(BSA，纯度198％，北京奥博星生物技术有限责任公司)；丙烯酰胺、Ⅳ，J7＼r’一甲叉双丙 马斯亮蓝G250，均为化学纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。 2．2实验过程 将活性染料与牛血清白蛋白在样品缓冲液中混合，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法对不同染料与蛋白 染色的时间(10～90 蛋白标记结果以整合密度值(Integrateddensity 件计算得出。 选用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(分离胶10％，浓缩胶5％【71)，电泳时设置初始电压约为70～ 80 h后升高电压至100—110 V，初始电流约为40—50mA，0．5 V，电泳时间约2h。电泳后直接观测， 需用考马斯亮蓝溶液进行染色，操作参考文献[7]进行。 2010旬1—19收稿；20104)4．10接受 本文系国家自然科学基金(No资助项目 ·E-mail：daibmdlm@yahoo．t?,om．cn 万方数据 1424 分析化学 第38卷 3结果与讨论 3．1反应原理 活性染料分子结构主要包括染料母体和活性基团两大部分。按活性基团不同，常见的活性染料可 分为：二氯均三嗪型(X型)、一氯均三嗪型(K型)、乙烯砜型(KN型)、一氯均三嗪与JB一乙烯砜硫酸酯 基复合型(M型)和双一氯均三嗪型(KE／KD型)。由于K型染料分子中只有一个活泼氯原子，所以反 应活性低，通常要在较高温度(90℃以上)的条件进行染色；而KE／KD型染料的反应活性与K型相 似【sJ，本研究中只选取X型、KN型和M型染料进行蛋白质标记。 通常活性染料对蛋白质纤维(丝绸、羊毛)染色 的化学反应原理如图1。 珂。旬竺鱼跏91 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质之 Y刑选二 h～O- 一，能够与类别广泛的内源物质(如代谢产物等