细胞检测研究.ppt

细胞检测方案汇报 HIV-抗体检测方法 （一）酶联免疫吸附测定法 采用双抗原夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV（1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。 配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。 编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。 加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min。 洗涤：小心把封板膜揭去，用洗板机选择5次程序，洗板后在干净纱布上拍干。 加酶：每孔加酶结合物100μl（空白对照孔除外），充分混匀，用封板膜封板后置37℃温育30min。 洗涤：小心把封板膜揭去，用洗板机选择5次程序，洗板后在干净纱布上拍干。 显色：每孔加入底物缓冲液50μl，TMB 50μl，轻轻振荡混匀，封板后置37℃避光显色10min。 测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀。设定酶标仪波长为450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630 nm），空白调零，读取各孔OD值。 HIV-抗体检测方法 （二）金标法检测 原理 利用双抗原夹心法检测HIV抗体。标本加入反应板，若标本中含有HIV抗体时，先与金标抗原反应，形成抗体-金标抗体复合物，在虹吸作用下向前移动，遇到包被抗原形成抗原-抗体-金标抗原复合物，并出现红色沉淀线。包被膜上同时带有一条质控包被线作为对照，所以当出现一条红色质控线和一条（或两条）红色反应线时判断为阳性。当待测标本中无HIV抗体时，只出现一条红色质控线则判断为阴性。作为质控，不管结果为阳性或阴性，都会出现一条红色质控线。如无红色质控线（或只有反应线）出现，则实验无效。 （1）、撕开包装有HIV-1+2抗体检测板的袋，取出检测板水平放置于实验台上。 （2）、用塑料吸管吸2-3滴血清标本（70-100微升）加入标本孔中。 （3）、15-30分钟内观察结果。 10、结果判断 （1）、阳性：出现两条或三条红线均为阳性反应。 （2）、阴性：仅出现质控一条红线，则实验结果为阴性。 （3）、无效：如无红线（或只有反应线）出现，表明实验无效，须重新检测。 质量控制： 阴性对照显示为阴性；阳性对照显示为阳性。 HBV-DNA荧光定量PCR检测 采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术，适用于检测人临床血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒DNA 仪器：Fluo Cycle型核酸扩增荧光检测仪为上海科华实验系统有限公司产品。HBV-DNA荧光定量试剂盒采用上海科华生物工程股份有限公司产品。 荧光探针实时检测定量PCR方法。从血清中提取HBV-DNA将其加入反应管，放入扩增仪进行扩增，反应结束后由电脑自动分析结果。 EBV-DNA荧光定量PCR检测 简单介绍 EB病毒（EBV）是在研究非洲儿童淋巴瘤（BL）时，从瘤细胞培养中发现的一种病毒，时传染性单核细胞增多症的病源，并与BL和鼻咽癌有关。 仪器试剂： EBV-DNA 荧光检测试剂盒 Fluo Cycle型核酸扩增荧光检测仪 CMV的检测方法 巨细胞病毒感染是先天性感染疾病的最常见的病因，能引起胎儿、婴儿严重损害，甚至死亡。尤其重要的是导致中枢神经系统的后遗症 常用方法有： （1）酶联免疫吸附试验检测孕妇血清巨细胞病毒IgG、IgM； （2）孕妇宫颈脱落细胞或尿液涂片行Giemsa染色后， （3）DNA分子杂交技术检测巨细胞病毒DNA， （4）PCR技术扩增巨细胞病毒DNA，短时间内获满意结果。 血清巨细胞病毒IgG、IgM 采用酶联免疫间接法原理定性检测人血清中的人类巨细胞病毒IgG抗体（HCMV-IgG），以纯化人类巨细胞病毒抗原包被酶联板。待检血清中的人类巨细胞病毒与包被抗原反应，再与酶标记抗人IgG抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。加底物TMB显色，在酶标仪上比色后根据吸光度（A值）判定有无人类巨细胞病毒IgG抗体的存在。 基本仪器：酶标仪 洗板机 乙肝表面抗原定量（HBSAg）酶联免疫吸附实验 设备和材料 酶标仪: KHB ST-360 洗板机: KHB ST-36W 精确移