第四篇 抗体制药.ppt

第四章 抗体药物 模板替换：用与鼠对应部分有较大同源性的人框架区替换鼠框架区。 表面重塑：对鼠CDR及框架区表面残基进行镶嵌或重塑使其类似于人抗体CDR轮廓或人框架区。 补偿变换：在人的框架区选择与CDR有相互作用，与抗体的亲和力有密切关系或对框架区空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植。 定位保留：在人源化的改形抗体中保留了鼠源性抗体可变区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR区和框架区中的一些关键残基。 三、小分子抗体 人-鼠嵌合抗体虽然能部分解决鼠源性单抗抗原性问题，但不能解决抗体分子量大，不易穿透组织的缺点。 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单抗的V区（即保留了CDR区），而Ig分子的C区不表达，因此其分子量仅为原抗体的1/80~1/3。 小分子抗体 （1）Fab片断抗体：包含有重链的VH+CH1以及完整的轻链。 （2）FV抗体：由VH和VL组成。 （3）单链抗体：由抗体VH和VL通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，具有分子量小、穿透力强、免疫原性小的特点，且易与效应分子相连接，构建多种新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体的理想元件。 （4）单域抗体：由VH或VL单个可变区组成，只有抗体分子的1/12，表面疏水性强，与抗原特异性结合的能力弱。 （5）最小识别单位：由单个CDR区构成的小分子抗体，具有与抗原结合的能力，但亲和力低，也称超变区多肽。 单链抗体的优点： （1）可去除许多造成非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显像的背景更清晰。 （2）更容易渗透到肿瘤组织中，增加有效药物的浓度。 （3）分子量小，抗原性小，能消除人抗鼠的排异反应，从而延长在人体内的半衰期。 单链抗体的构建 方法一：杂交瘤细胞提取mRNA 反转录 cDNA PCR扩增 VH和VL基因 合成接头 用接头将VL的C端和VH的N端或VH的C端与VL的N端连接 单链抗体 单链抗体 接头：又称linker，必须能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并尽可能减少蛋白酶攻击和防止单链聚集。 Linker长度为14~25个氨基酸为宜，目前最常用的为15肽序列（Gly4Ser）3。 方法二：噬菌体表面呈现技术，可用于单链抗体的构建。 单链抗体可在大肠杆菌中表达，有3种表达方式 （1）直接在细胞质中表达 （2）与其他菌体蛋白融合表达成融合蛋白 （3）分泌表达具有功能的单链抗体：将单链抗体基因与引导分泌的信号肽基因相连接，使表达产物分泌出来，获得有活性的可溶性表达产物。 四、双功能抗体 （1）化学交联法：用化学试剂交联Ig分子表面的巯基。 （2）生物学方法：将分泌单抗的杂交瘤细胞与分泌另一种抗体的脾细胞融合，形成可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的杂种-杂交瘤细胞。 （3）基因工程法：用接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性抗体（SCFV)2。 双功能抗体的优点：避免了化学交联对抗体的损害，又可定向结合抗原部位，减少非特异性分布和副作用。 双功能抗体抗肿瘤：双功能抗体的一个臂识别肿瘤相关抗原，另一个臂识别免疫效应细胞及分子，如CD3、毒素、药物等，介导T淋巴细胞、LAK细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用。 CD3分子的主要功能是参与TCR/CD3复合体的装配和稳定以及信号转导 NK细胞或T细胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 五、抗体融合蛋白 （1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ （2）配基-Ig型嵌合蛋白，如IL-2-Ig，应用较为成熟。 （3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3 （4）受体-FV型融合蛋白 （5）酶-抗体型融合蛋白：即为抗体酶，当抗体酶和肿瘤结合后，给与前体药物，在酶的转化下成为有效药物，可提高组织内药物浓度，提高药效，降低毒副作用。 抗体融合蛋白的构建：将第一个蛋白的终止密码子去除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表