荧光定量PCR技术4ppt课件.pptVIP

SYBR Green I 工作原理 结合解离曲线识别不同的PCR产物 SYBR Green I的特点 可以用于不同的模板 使用方便，价格相对便宜 灵敏度很高 与非特异性产物结合 解离曲线 选择良好的引物和探针并优化反应条件 随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系 TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等 其结果都具有高特异性与高敏感性 但只适合于一个特定的目标 分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 特别适用于检测点突变 只能用于一个特定的目标 设计困难 价格较高 常 用 的 热 循 环 仪 ABI Prism 7700 可以在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增 一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只需要2～3小时 用于水解探针、双链DNA结合染料、分子信标的分析 但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析 * 未结合的SYBR green I 95 ℃ 15sec; 60℃ 20sec; 95 ℃15sec 在60 ℃ ～95 ℃ 之间的Ramp time设为19:59 TaqMan Probes 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX VIC TAMRA DABCYL TaqMan Probes工作原理 探针与目标序列配对时 ，发生 FRET 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 TaqMan MGB探针 荧光素 非荧光淬灭基团 与目标序列互补 MGB (Minor Groove Binder) 将探针的Tm值提高10℃ 因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。 TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 分 子 信 标 (发夹型杂交探针) 荧光基团 茎由互补配对的序列组成 环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 分 子 信 标 工 作 原 理 探针杂交到DNA模板 光 发出荧光 荧光基团 DNA 模板 淬灭剂 茎 环 光 淬灭 96 Microplate Mx4000 Multiplex Quantitative PCR Stratagene 32 Capillaries LightCycler Roche Molecular Biochemicals 32 72 Tubes Strip tubes Rotor-Gene Corbett Research 16 Tubes Smart Cycler Cepheid 96 96 Microplate Tubes iCycler iQ Bio-Rad 96 96 96, 384 Microplate Tubes Microplate Tubes Microplate ABI Prism 7700 SDS GeneAmp 5700 SDS ABI Prism 7900 HT SDS Applied Biosystems Max sample number Sample format PCR system Company *