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MDCK细胞培养 技术 肖敏 2009.12.24 Contents 培养基与培养条件 细胞培养液：90 ％ MEM+10％FBS+1％PS 冻存液：90％FBS+10％DMSO 培养箱温度：37℃ 二氧化碳浓度：5％ MDCK细胞的复苏 仪器和耗材： 温水（37 ℃~40 ℃ ） 温度计 废液缸 培养液 吸量管 移液器 离心管（15mL） 细胞培养瓶 步骤： 在资料库中找出所要细胞的位置，并更改好资料。从-196 ℃液氮中取出细胞管，投入温水中，尽快使其溶解，加入适量的培养液稀释，离心，去上清，敲散细胞，加入培养液于培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。 MDCK细胞的传代 仪器和耗材： 培养液 0.25％的胰酶 PBS 离心管 细胞培养瓶 吸量管 移液器 废液缸 步骤： 1.镜下观察细胞生长情况，密度等，以决定消化的时间。 2.用PBS洗两次，PBS要打在细胞瓶侧壁，以免直接冲洗细胞造成细胞损伤，液体易残留在细胞瓶口，造成污染，要加以注意。 3.加入胰酶，胰酶的量是随细胞的生长密度而定，一定量的胰酶消化一定量的细胞，一般情况下，75T细胞瓶加入4mL胰酶，25T细胞瓶加入2mL胰酶，以胰酶能覆盖整个瓶底为准。 4.因胰酶最佳消化温度是37℃，可把细胞瓶放入培养箱中，定时镜下观察，当细胞收缩、变圆、单个分开时可终止消化，轻轻敲打细胞瓶使细胞脱落，加入等量的培养液中和。 5.吹吸混匀细胞，把液体转移至15ML离心管中，5分钟，800转离心下细胞。 MDCK细胞冻存 仪器与耗材 FBS DMSO 培养液 PBS 0.25％的胰酶 冻存管 封口膜 程序降温盒 吸量管 移液器 废液缸 冻存的细胞密度较稀，取对数生长期细胞，大概70％~80％满瓶就可冻存，冻存的量根据密度而定，一般70％ ~80％满瓶的一瓶75T细胞可冻存5管左右。 * * MDCK细胞复苏 MDCK细胞传代 MDCK细胞冻存 注意事项： 液氮温度极低，在使用过程中要做好防护（戴棉手套、不穿露趾鞋等），防止冻伤。? 在液氮中操作时速度要快，要注意轻拿轻放，以免内容物解冻，造成不必要的损失。 ?在使用液氮时，要保持通风良好，以避免空间缺氧，造成窒息。? 因DMSO在常温下对细胞有毒性，解冻后要尽快稀释。 6.小心弃去上清，轻轻敲打在离心管底部的细胞，加入培养液稀释重悬，稀释的倍数根据细胞生长的密度与传代时间决定，也可通过细胞计数而定。最后把细胞置于细胞培养瓶中培养。培养液的量一般是75T细胞瓶加入10mL培养液，25T细胞瓶加5mL培养液。 7.轻摇细胞瓶，使细胞均匀平铺于细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。每日观察其生长情况。 MDCK 步骤：(前面步骤与细胞传代相同） 细胞消化下来后，倒掉上清，把细胞敲散，加入事先配好的冻存液（90％FBS+10％DMSO），充分混匀，分装成1mL/管，并在管上标上细胞名称、代数、冻存日期与操作者，封上封口膜，放入程序降温盒中，把程序降温盒整个放入﹣80 ℃冰箱，过夜后放入﹣196 ℃液氮罐中长期保存。 注意事项： 由于DMSO稀释时会释放大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞中，必须使用前先行配制 。DMSO在常温下对细胞有毒性，特别是在大批量冻存的时候，可先把配好的冻存液放入冰水中降温，同样，程序降温盒也可先放入 4 ℃冰箱中预温。如果没有程序降温盒的情况下，可采用逐步降温来冻存（4℃半个小时→﹣20℃半个小时→﹣80 ℃ 16-18（或过夜)→液氮长期保存） 霉菌污染 CPE