第五章 植物基因工程.pptVIP

特点： ⑴ 外植体细胞经历脱分化和再分化两个过程 ⑵ 扩繁量大 ⑶ 外植体试材广泛 ⑷ 该再生系统获得的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差 ⑸ 该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物 ⑹ 嵌合体多 3.2 直接分化再生系统 所谓直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。 用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体。 特点： ⑴ 获得再生植株的周期短，操作简单。 ⑵体细胞无性系变异小。 ⑶较多的嵌合体 ⑷转化频率低于愈伤组织再生系统 3.3 原生质体再生系统 特点： ⑴原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核。 ⑵通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆，嵌合体少。 ⑶原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定。 ⑷原生质体培养用期长、难度大、再生频率低。 ⑸遗传变异大，遗传稳定性更差。 3.4 胚状体再生系统 植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成的一个新的个体的形态发生过程。 经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，称之为体细胞胚或胚状体。 特点： ⑴ 胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，这些胚性细胞具有很强的接受外源DNA的功能转化率和转化效率均高。 ⑵ 多数单细胞起源，嵌合体少。 ⑶ 胚状体具有两极性，即在发育过程中同时可分化出芽和根形成完整植株，这样减少了不定芽发育途径中比较困难的一个环节——生根培养。 ⑷ 利用转基因的胚状体可以生产人工种子。 ⑸ 体细胞胚成苗快、数量大有利于生产和推广。 3.5 生殖细胞受体系统 利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也称之为种质系统。 两个途径利用生殖细胞进行基因转化： 一、利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成单倍体植株，以此为受体进行转化。 二、直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。 特点： ⑴ 有更强的接收外源DNA的能力。 ⑵ 能使转基因充分表达，而且通过加倍后即可成为纯合二倍体，加速纯化过程。 ⑶ 利用植物自身的授粉过程操作方便。 ⑷利用该受体系统进行转化受到季节的限制。无性繁殖的植物不宜采用。 4 植物表达载体的组成特点 植物基因表达载体的主要功能是在受体细胞中表达外源基因（大多数是以Ti质粒为基础构建的）：启动子、终止子、T-DNA序列、内含子序列、选择标记基因和报告基因 启动子：按其功能分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子 组成型启动子：外源基因在其调控下，表达大体恒定在一定水平，在不同组织部位没有明显差异，没有时空特异性。如：Ti质粒的胭脂碱合成酶基因（nos）启动子。 诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可大幅度提高外源基因的表达水平。如：光、热和创伤诱导启动子等。 组织特异性启动子：该启动子控制的基因只发生在特定器官或组织部位，并表现出受发育过程调控的特性。典型例子如：马铃薯块茎蛋白基因启动子，只在块茎中表达。 终止子：TGA和TAA 不同来源的终止子对外源基因的表达有很大的影响，它不仅决定外源基因的转录活性，也决定mRNA在细胞中的稳定性，从而影响mRNA的翻译。 T-DNA序列：构建表达载体的一个关键元件 T-DNA序列进入受体植物细胞后有两种命运： 内含子序列 真核基因常被一个或数个内含子分隔，转录后的前提mRNA经剪切后变为成熟的mRNA. 研究表明内含子与基因表达有很大关系，它促进基因的表达是通过增强活性mRNA含量，从而有利于基因的表达。所以构建基因表达载体时，可根据不同基因类型，有选择的插入内含子序列。 选择标记基因和报告基因 选择标记基因：是在选择压力下将转化体筛选出来，因此它实际上是一种未转化细胞的抑制剂，但它对转化细胞的生长和分化不影响。 报告基因：报告和识别作用，它的表达产物对植物无毒性，它反映外源基因在植物细胞中的翻译水平。如：细菌和萤火虫的荧光素酶；绿色荧光蛋白 转入荧光素酶的烟草 提高外源基因在植物细胞中表达效率的策略 1.构建高效表达的转化载体 选择合适的启动子（如组织特异性启动子、强启动子） 构建完整的基因表达调控序列-转录和翻译 合理插入内含子-提高外源基因的表达 2.防止外源基因失活 在某些情况下外源基因表现为基因沉默。造成沉默的原因很多。它可能与基因的重复拷贝、DNA甲基化、染色体结构重拍和转录产物的不稳定等有关。 在基因工程中，分离单拷贝的转基因个体，构建含有核基质支架附着区的转化载体， 根癌农杆菌TI质粒介