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第五章 PCR引物设计 PCR技术的应用 研究领域：基因克隆、测序、重组 疾病诊断 法医鉴定 亲子鉴定 古生物学研究 PCR及其衍生技术 兼并引物PCR RACE 反向PCR（IP-CR） 差异展示PCR(DD-PCR) 多重PCR TD-PCR PCR-SSCP Net-PCR IC-PCR Hotstart PCR SPA PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。 引物最好在模板cDNA的保守区内设计 保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 同时应预测将扩增的片段单链是否形二级结构。如这个区域单链能形二级结构，就避开它。如这一段不能形二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 1、引物设计的原则 引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。 引物设计需要考虑的因素 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) ΔG值 (internal stability) 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition） 有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。 引物设计要点（1） 引物长度: 一般，引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp。 引物设计要点（2） 引物3′端 引物3′端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 3′端防止连续三个C或G 3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，3′端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构可能， 扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位? 引物的5′端? 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。?  引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物设计要点（3） 引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（72℃）或过低（37℃）都不利于引发反应。上下游引物的Tm 不能相差太大。 长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size???????? ?? 公式中，Size = 引物长度。 PCR退火温度为Tm-5 ℃ 引物设计要点（4） 选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。 ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度 引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合。因此，5′端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 引物设计要点（5） 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 引物设计要点（6） 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 引物设计要点（7） 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 基因中不能含有任何选择的酶切位点序列 酶切位点加在上下游引物的5’端保护碱基的设置所有酶切位点都要加上适当的保护碱基，不同的保护碱基切割效率不同。 末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开， 因此人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 先设计引物，对其退火温度和GC含量评价，完后直接在引