第一章 酶ppt课件.pptVIP

星号活性？ 合成cDNA的主要步骤： 1、应用poly(A)mRNA为模板，以12~18个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链; 2、用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成； 3、用SＩ核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。 4、通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。 T7DNA聚合酶： 1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。 具有5’ 3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’ 5’核酸外切酶活性。 T7DNA聚合酶的用途： 1、用于对大分子量模板的延伸合成； （不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可 延伸合成数千个核苷酸） 2、 通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端 3、 将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末 端的结构。 修饰的T7DNA聚合酶 对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’ 5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。 用途： 1、作为一种DNA序列分析的工具酶： 加工性能高；无3’ 5’的外切酶活性； 具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。 2、制备探针；可催化较低水平的dNTP （0.1 μmol/L ）参入。 3、有效的填补和标记具有5’突出末端 的DNA片断的3’-末端。 聚合作用高；失去了3’ 5’的外切酶活性 * 左下角处有超级链接到配伍末端 * 衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。 衔接物连接法 双衔接物连接法的基本程序 cDNA链的合成 通过DNA聚合酶合成第二链 加入Sal I衔接物 S I核酸酶作用后的末端单链突出序列， 由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I 在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。 DNA接头（adapter）连接法： 1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞 博士发明的。 它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。 粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。 DNA接头连接法 热稳定的连接 从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。 寡核苷酸连接测定 （oligonucletide ligation assay,OLA） 用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶 DNA分子的位置是相邻的。 连接酶链式反应（lingase chain reaction,LCR）； 也叫连接扩增反应（ lingase amplication reaction） 用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物， 寡核苷酸连接测定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G