第三章生物大分子色谱分离与纯化.ppt

有效柱长（Leff）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相时，溶质在色谱柱上迁移的距离，又叫有效迁移距离。 流动相的线性流速 梯度陡度 分别使溶质迁移速度Ux=0，Ux=U时的瞬时容量因子 3-6 从（3-6）可以看出：在其它色谱条件相同的的情况下，有效迁移距离随溶质的不同而变化。对同一种溶质而言，k’1值愈小，其对应的Leff就愈小，洗脱所需要的时间也就愈短，反之，洗脱所需的时间就愈长。 二、有效柱长和最短柱长 2. 最短柱长 最短柱长（Lmin）：混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短柱长。 * * 第三章 生物大分子的色谱分离与纯化 第一节 色谱概论 第二节 基本理论 第三节 色谱条件及色谱纯化工艺的最优化 第四节 蛋白质的色谱复性及同时纯化 第五节 应用举例 第一节 色谱概论 一、色谱的概念 色谱（层析）是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分子大小等基础上的分离过程。 二、色谱的特点 能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并检测出来。 它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经过连续多次在两相中的质量交换，从而使不同组分得以分离，这就是色谱法所依据的基本原理。 必要条件 充分条件 2. 色谱具有高效、快速和灵敏的特点 三、色谱的分类 平板色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱(液相) 填充柱色谱 空心柱色谱 高效液相色谱 柱色谱(气相) 填充柱色谱 空心柱色谱 板状 纸 一薄层 根柱子 填充紧密 空心管壁 流动相高 压 根柱子 填充紧密 空心管壁 液液分配色谱 液固吸附色谱 凝胶渗透色谱 离子交换色谱 亲和力色谱 气液分配色谱 气体吸附色谱 分配系数 吸附能力 分子大小 离子交换 能力 亲和力 分配系数 吸附能力 液相色谱 液液色谱 液固色谱 气相色谱 气液色谱 气固色谱 液相 固相 液体 固体 液相 气体 名 称 物理特性 名 称 原 理 名 称 固定相 流动相 固定相的物理特性 作 用 机 理 两 相 物 理 状 态 现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。选择的原则： 易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱； 水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交换色谱； 样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。 除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。 四、柱色谱的操作程序 几个专门术语 装柱（packed） 上样（loading） 洗脱（eluting）-展层（developing） 床体积（bed volume） 洗脱体积（eluting volume） 2. 柱层析系统的组成 柱层析系统 储液瓶 梯度三通阀 混合器 蠕动泵 层析柱 紫外检测器 记录仪 分部收集器 控制器 3. 柱色谱的操作程序 1）装柱 要求：不能有断层现象；不能有气泡； 压力适当。 2）上样 样品浓度越高越好；上样体积越小，分辨率越高； 上样体积一般为床体积的1～5%； 例外：G-25脱盐——30% 亲和层析——为床体积的几倍 3）洗脱 影响分离效果的主要因素之一： 洗脱流速。 要求流速合适而恒定。 洗脱方式 连续洗脱（continual elution）：同一种洗脱液洗脱 分步洗脱（stepwise elution）：用两种或两种以上不同洗脱液分段洗脱 梯度洗脱（gradient elution）：梯度改变洗脱液的pH值、离子强度或极性 梯度洗脱液的制备装置：梯度混合器、梯度三通阀或简易梯度形成装置 梯度形式：直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯度、凸指数梯度以及复合梯度 4）洗脱液的分部收集 收集的办法：用小试管每管收集一定的体积，直到洗脱完毕为止。 收集的体积（或时间）：随样品的性质、填料、柱子的直径和流动相而变化。一般每管收集的体积 为3～5mL（实验室）。 收集的总体积：离子交换层析为床体积的3～５倍； 凝胶层析为1个床体积 5）洗脱液的检测和合并 分部收集的