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生物化学实验技术与方法 实验讲义 生物化学教研室 （2005年9月） 目录 实验一：糖的薄层分析---------------------------------------2 实验二：高等植物DNA的提取和纯度鉴定------------3 实验三：苯丙氨酸解氨酶的纯化和活性测定-----------5 实验四：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 ---------------------------------10 实验一 糖的薄层层析 实验目的 学习和掌握薄层层析的原理和方法 实验原理 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。 根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。 本次实验是以硅胶H为吸附剂的薄层层析。硅胶H是粘性差的纯硅胶；其特性是能用腐蚀性显色剂检测。 实验操作 1. 硅胶H薄板的制备：注意胶要均匀。 2. 板的处理： 薄板的活化：活化后冷却的速度不能过快。 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。 3. 点样：样品为鼠李糖、甘露糖、木糖和葡萄糖。点样量20-30μl。注意：点样点的直径小于2mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。 4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。 结果与讨论 1. 根据显色结果，计算Rf值，根据颜色、Rf值判断糖的存在。 2. 哪些因素对薄层层析的结果产生影响？ 实验二 高等植物DNA的提取和纯度鉴定 一、实验目的 掌握提取真核细胞DNA的一种基本方法，学习紫外吸收法测定DNA的含量和纯度。 二、实验原理 高浓度的盐和离子表面活性剂SDS能破坏细胞膜，并能解聚脱氧核糖核蛋白复合物（DNP），使DNA释放出来。 苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可除去一些盐分，经RNase降解RNA，可得较纯的DNA。 DNA含量与纯度的测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式（DNA[ug/ml]=A260×50×稀释倍数）可计算出DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260/A280〈1.8时，表明蛋白质含量偏高；A260/A280〈1.9时，表明样品较纯；A260/A280〉2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。 三、仪器、试剂和材料 仪器 普通离心机；冰箱；恒温水浴箱；紫外分光光度计；可调整微量取样器；50ml量筒；2ml烧杯；滴管 试剂 抽提液（2mol/LNaCl-1mmol/LEDTA）；10%SDS；盐饱和苯酚（SS-苯酚）：重蒸苯酚用1mol/Ltris-HCl缓冲液（pH8.0）饱和；氯仿－异戊醇氯仿－异戊醇预冷95％乙醇氯仿－异戊醇phenylalanine：ammonia lyase，PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸反式肉桂酸PAL活力。规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。酶的比活力是指样品中煤毫克蛋白质所含的酶活力单位数。在实验中将会看到，随着PAL逐步被纯化，其比活力也逐步增加。 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称为100%饱和度。沉淀某一种酶所需的具体浓度，需要经实验确定。 交联葡聚糖凝胶（商品名称为sephadex）是由细菌葡聚糖长链，用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷交联而成。凝胶商品名后面的G值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析过程中流速快。 根据需要，选用一定型号的凝胶作柱层析介质（蛋白脱盐一般用G-25或G-50，G-100~G-200分离不同分子质量的蛋白质组分）。由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的由于不能进入凝胶的网孔中，而沿着颗粒间间隙最先流出柱子；分子质量小的由于进入凝胶网孔中被组阻滞，从而后流出柱子，达到分离的目的。 DEAE纤维素是