MTT实验方法.pdf

一、 原理 黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶 能使外源性MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan 结晶并沉积在细胞中，结 晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸 收值，可间接反映细胞数量。 二、实验步骤（实用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96 孔板，每孔180μl，3000-10000 个 /孔。 2 ）置37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁，培养6-24 小时。 3 ）加入待筛样品20μl，继续培养44 小时。 4 ）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640 培养液，再加入20 ul MTT 溶液（5 mg/ml， 即0.5%MTT ），继续培养4 h 。 6 ）然后吸掉上清，每孔加入150 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶 物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值。 7 ）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物 溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3 复孔。 8 ）计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.有依据吗 MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂3- (4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化 合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸 脱氢酶和细胞色素C 的作用下tetrazolium 环开裂，生成蓝色的formazan 结晶， formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失， 不能将MTT 还原）。还原生成的formazan 结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺 和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT 溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm 处的光密度OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。 MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关 闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 MTT 步骤如下： 1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000 个细胞接种到96 孔板，每孔体积200ul. 2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5 天（可根据试验目的和要求决定培养 时间）。 3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT 溶液（5mg/ml用PBS lt;ph=7.4gt;配)20ul. 继续孵育4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心 后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10 分钟，使结晶物充分融 解。 4：比色：选择490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果， 以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 注意事项： （1）选择适当得细胞接种浓度。 （2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后 尽量吸尽孔内残余培养液。 （3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤 保持一致，最后比色以空白调零。 MTT 实验吸光度最后要在0-0.7 之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50 是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的 浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图， 然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2 倍稀释，多做 梯度，做点线图即可！ 举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍 数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。 代入 计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1- (3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025 有一个公式可供参考; lgIC50=Xm-I(P- (3-Pm-Pn)/