分子生物学常用技术1电泳a.ppt

电泳技术思考题 1名词解释 电泳、电泳分离技术、电渗、不连续凝胶电泳 2 影响电泳的主要因素有哪些？ 3 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？ 4 不连续电泳样品压缩成层原理。 5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 6 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何测定蛋白质等电点？ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3 1．过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）号试剂比例调整随温度改变。 2．制胶时，要充分摇匀，及时灌胶，及时冲洗玻璃滴管。 3．加注水层必须缓慢细流，量适中。 4．Acr和Bis有毒。 5．固体胶切忌倒入水池。 注意事项： 7.2. SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） ： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于:所带净电荷、分子的大小、形状等因素。 加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 SDS-凝胶电泳原理 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使Proteins二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到Proteins分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。 测定： 测分子量（与标准蛋白比较） 鉴定样品纯度（条带数目） 测定样品P含量：扫描定量（比色） 试剂与器材 试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床 操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。 3. 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将上、下贮槽的蒸馏水倒去 ，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。 4. 样品的处理及加样 将样品按0.5–1 mg/mL加样品溶解液( 10 fold SDS)，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。 用微量进样器取25 ?l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。 5 .电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。 6 .染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 7. 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 相对迁移率mR=