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第二章 DNA重组克隆的单元操作 2014年2月 本章节内容 DNA重组的载体(装载DNA的工具） DNA的体外重组（切、连） 重组DNA分子的转化与扩增（转、增） 转化子的筛选与重组子的鉴定（检测） 目的基因的克隆（供体中的目标DNA的克隆） 第一节 DNA重组的载体 质粒载体 λ双链噬菌体DNA载体 M13单链噬菌体DNA载体 噬菌体-质粒杂合载体 载体的功能 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞中的复制、扩增或整合能力（指DNA 拷贝数的增加）（所有载体必须具备的能力） 为外源基因提供在受体细胞中的表达能力（指基因的表达，使外源基因通过mRNA和蛋白质在受体细胞中发挥功能，进而可发现基因在生物体内发挥的作用）。 载体必须具备的三个条件 具有复制原点或整合位点，能使外源基因在受体细胞中稳定遗传。 既有多种单一的核酸内切酶的识别切割位点（多克隆位点，multi-clone site, MCS)。 具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测。 一、质粒载体 （一）质粒的基本性质 存在于细菌或真菌的细胞 质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价、闭环，双链DNA分子（covalently closed circular DNA, cccDNA)。 大多数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞复制周期 一、 质粒载体 （一）质粒的基本性质 质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。 选择性标记(selectable marker):由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒. （一）质粒的基本性质 1、质粒的自主复制性：含有Ori或replicon 质粒在特定的宿主细胞中维持恒定的拷贝数。 A、反义RNA进行调控的机制 B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 A、反义RNA进行调控的机制（plasmid Col E1 ） B、 如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNA II，复制不能进行。 c、 当质粒的浓度比较高的时，Rop蛋白促进RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。 d 、 当质粒的比较低时，RNA II与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNA II 质粒复制起始。 e、突变RNA I或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。 B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理（ pS101质粒） B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。 如果质粒拷贝数高， RepA蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复制受到抑制。 RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA的合成 。 问题：在寄主复制后，质粒是如何分配到子细胞中？ Par原件会附着在细胞膜上，随着细胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中，维持相对稳定的质粒拷贝数。 （一）质粒的基本性质 2、质粒的可扩增性（质粒的拷贝数） 拷贝数：细胞中质粒的数量（摩尔数）与染色体DNA数量之比 严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1~几个） 松弛型:多个拷贝存在于细胞中（≥10） 严谨型与松弛型是相对的。 （一）质粒的基本性质 3、不相容性 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒称为不亲和质粒 （一）质粒的基本性质 引起质粒的不相容的机理 A 具有相同的复制调控机制 B 控制质粒分配的par元件相同,也会引起质粒的不相容 不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1 （一）质粒的基本性质 4、质粒的可转移性（p13) （二）、质粒的改造和构建 天然的野生质粒一般不能直接用作克隆载体，需要改造 1、删除不必要的DNA序列，缩小质粒相对分子量，提高外源DNA片段的装载量。 2、灭活一些质粒的基因（如可转移基因），保证重组实验的安全；灭活质粒拷贝数的负控制基因，提高质粒的拷贝数。 3、加入选择性标记，便于重组子的检测 4、加入多克隆位点，便于外源基因的插入 5、根据克隆的目的，加装特殊的表达元件或便于蛋白纯化的元件（GST标签） （三）、质粒的分类及用途 1、克隆质粒：能在宿主细胞中高拷贝存在（含有氯霉素可扩增的松弛型复制子或解除了对质粒拷贝