第二章-1用于核酸操作的工具酶-98.ppt

一、用于核酸操作的工具酶 DNA聚合酶的共同特点： DNA聚合酶的主要区别： T7 DNA pol的用途： 修饰的T7 DNA pol： TdT的用途： 2、标记DNA片断的3’端 2）随机引物标记法： 随机引物(random primer) ： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。 逆转录酶 dNTPs（?-32P-dATP） 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ mRNA 3’ cDNA 使长6-8bp的随机引物与RNA模板退火，在逆转录酶作用下，引发cDNA链合成，将?-32P-dNTP掺入合成链，即得到标记。 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ mRNA random primer 随机引物标记法： （三）核 酸 酶 单链核酸外切酶 双链核酸外切酶 单链核酸内切酶 单链内切双链外切核酸酶 1、单链核酸外切酶 E.coli 核酸外切酶VII (ExoVII)：不需Mg2+ 。 ExoVII 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ExoIII Mg2+ 3’ 5’ 3’ 5’ E.coli 核酸外切酶 III (ExoIII)：特异性从3’端外切。 2、双链核酸外切酶 ?Exo 3’ 3’ 5’ 5’ Mg2+ 3’ 5’ 3’ 5’ ?核酸外切酶(?Exo)：特异性从5’端外切。 S1核酸酶：来自稻谷曲霉菌(Aspergillus oryzae) 降解单链DNA的速度比双链DNA快75,000倍； 降解单链DNA的速度比单链RNA快7倍； 需低浓度Zn2+； 最适pH为4.0-4.3； 需10-300mM NaCl。 3、单链核酸内切酶 1、内切单链DNA或RNA 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ S1 Zn2+ 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ 5’ … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’ 5’ dNMPs 或 5’ NMPs 用途： 2、内切带缺刻或缺口的双链DNA或RNA 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C A-C- C-T-C-A… 5’ gap 5’ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’ nick S1 Zn2+ 5’ … G-C-T-C-A-G 3’ … C-G-A-G-T-C T-G-G-A-G-T… 3’ A-C-C-T-C-A… 5’ 下一段DNA 5’端的核苷酸不断被移去，上一段DNA 3’端的核苷酸又按顺序增补，于是缺刻就沿着DNA合成的方向移动。 5’ 3’ 5’→3’外切酶活性从DNA分子单链缺刻的下一段DNA 5’端除去1个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺刻的上一段DNA的3’端补上1个新的核苷酸。 nick nick 5’ 3’ 缺刻平移法制备同位素标记的DNA探针： 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’ 5’ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ nick DNase I Mg2+ dNTPs（?-32P-dATP） 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’ DNA pol I 1?g纯化的DNA片断 适量DNase I DNA Pol I 未标记的dNTPs 1种标记的dNTP（ 如?-32P-dATP ） 制备DNA探针的反应体系： 25?l体系： DNA pol I： 进行缺刻平移，使反应混合物中32P标记的核苷酸取代原有未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。 DNase I： 造成DNA分子的缺刻。 2、Klenow酶 E.coli DNA pol I 经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端2/3的大肽段，即为Klenow酶。 失去5’→3’核酸外切酶活性。 5’→3’DNA聚合酶活性； 3’→5’核酸外切酶活性（较低）； 双脱氧末端终止法测定DN