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Central Laboratory of Biology College of Life Sciences, Hubei Normal University Central Laboratory of Biology Central Laboratory of Biology 实验五　微生物大小及数量测定 微生物学实验 课前提问与目的要求 【课前提问】 1.显微测微尺测量微生物大小的原理是什么？ 2.测定过程中应注意哪些问题？ 【目的要求】 1. 学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。 2. 掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。 【基本原理】 微生物细胞的大小是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。其测量工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻标准刻尺的载玻片，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100小格，每一小格长度为0.01mm，即10μm。 图5-1 镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺 目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。 【基本原理】 【实验用品】 1.菌种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和迂回螺菌的染色玻片标本。 2.试剂：香柏油，二甲苯。 3.仪器和其他用品：镜台测微尺，目镜测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸等。 【方法步骤】 目镜测微尺的安装 校正目镜测微尺 菌体大小的测定 测定完毕 1）使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻尺外的圆圈线进行准焦后再通过移动标本推进器进行寻找。 2）细菌个体微小，在进行细胞大小测定时一般应尽量使用油镜，以减少误差。 3）细菌在不同的生长时期细胞大小有时会有较大变化，若需自己制样进行细菌细胞大小测定时，应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料。 获得本实验成功的关键 【注意事项】 1.目镜测微尺很轻、很薄，在取放时应特别注意防止使其跌落而损坏。 2.观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。 【实验报告】 1. 结果 1）将目镜测微尺校正结果填入表5-1中 表5-1 目镜测微尺校正结果 油镜 高倍镜 低倍镜 目镜测微尺每格代表的长度/μm 镜台测微尺格数 目镜测微尺格数 物镜倍数 物镜 目镜放大倍数： 2）将各菌测定结果记录填入表5-2中。 迂回螺旋菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 平均值(μm) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 注：球菌用直径（宽度）表示细胞大小，杆菌和螺菌用宽度×长度表示细胞大小。 表5-2 金黄色葡萄球菌大小测定记录 【实验报告】 3）用表5-3对各菌测定结果进行计算和表述。 迂回螺菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 菌体大小 长度 μm 目镜测微尺平均格数 宽度 μm 目镜测微尺平均格数 长 宽 目镜测微尺 每格代表的 长度/μm 细菌名称 注：球菌用直径（宽度）表示细胞大小，杆菌和螺菌用宽度×长度表示细胞大小。 【实验报告】 2. 思考题 1）为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 2）在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？ 【实验报告】 第二部分 显微镜直接计数法测定微生物数量 【课前提问】 1.血球计数板的基本原理是什么？ 2.显微镜直接计数法的优缺点是什么？ 【目的要求】 1.明确显微镜计数的原理； 2.学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 【基本原理】 血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一段横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16小方格（图5-2）；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（10-4mL）。 以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A， 菌液稀释倍数为B，则： ×25×104×B 1mL菌