蛋白电泳及印迹技术1.ppt

如图2所示，左侧为夹心垂直板电泳槽示意图，右侧为凝胶模示意图 * SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的精髓在于它的不连续体系，由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP（过硫酸铵）催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 * 通过三种效应，样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应完成样品分子的电泳和分离。其中样品浓缩效应由4个不连续性完成，包括凝胶孔径的不连续性，缓冲液体系离子成分及pH值的不连续性，电位梯度的不连续性。其中最复杂的是缓冲体系离子成分及pH值的不连续性，在浓缩胶部位形成了泳动速度不同的快离子即氯离子，慢离子是甘氨酸根离子，蛋白质分子则处于两者之间，因此蛋白质分子得到了压缩。在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；浓缩效应即消失，进入分离阶段。 * 在浓缩胶中样品得到了浓缩，这种浓缩效应是由四个不连续性形成的，原理包括：缓冲液成分及pH的不连续性，电位梯度的不连续性。蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 * 电荷效应，当蛋白质样品进入分离胶后，pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。 * C.分子筛效应，分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 * 三 操作步骤 ㈠ 贮液及凝胶溶液的配制 根据所要分离蛋白质的分子量选择合适的凝胶浓度。表格内为5%的浓缩胶及10%的分离胶的配制。按照表格首先配制各贮存液并定容后，按照顺序加入相应试剂贮液配制不同浓度的凝胶溶液。 * （二）样品制备 将蛋白质定量后溶解在含10g/L SDS、10g/L巯基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液中，100℃加热2～5min。蛋白质的最后浓度一般为0.05～1g/L。 也可以将上述溶液在37℃保温2h而不是100℃加热。一般说来，两种处理的效果都一样。但如蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37℃处理就会引起样品水解，使测定失败，而100℃加热3min一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需要采用特殊的样品处理方法。 * （1）电泳第一步制备凝胶板，首先安装模具，洗净玻璃板，将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (2）将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。 （3）用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固（4）倒去分离胶表面的蒸馏水，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板。 （5）静置10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，制胶完成。安装模具后入电泳装置，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。 * 2. 加样 用电泳缓冲液冲洗加样孔，用微量注射器按顺序向凝胶板中加样，每孔加一种样品，各加20μl（含蛋白质10μg），同时加入标准蛋白质marker。多余的加样孔用等量的1X上样缓冲液补足。 3. 电泳 加样完毕，正确连接电泳槽及电泳仪, 打开直流稳压电源（负极接上槽，正级接下槽，事先接好），将电流调至每管8mA。保持电流强度不变，待溴酚蓝染料迁移至距下口约1cm处，停止电泳。约需1.5～2.0h。 * 4.染色与脱色：电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，撬时最好在流水下边冲边撬，防止损坏短玻璃板的边角。从凝胶板上切下一角作为加样标记； 加入特定的染色液染色1-2 h，再用相应的脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 * 剥胶时如图所示，用不锈钢药铲或镊子撬开