生物化学实验讲稿.doc

实验四 双缩脲法测定蛋白质浓度 [实验原理] 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。 [实验仪器及用品] 实验器材：容量瓶、试管、吸管、722型（或7220型）分光光度计。 实验试剂：双缩脲试剂；卵清蛋白质溶液；未知液 [实验内容及步骤] 一、标准曲线的绘制 将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。 瓶号 2mg/ml卵清蛋白液体积 蒸馏水 蛋白质浓度/（mg/ml） 1 1.0 稀释至刻度 0.2 2 2.0 稀释至刻度 0.4 3 3.0 稀释至刻度 0.6 4 4.0 稀释至刻度 0.8 5 5.0 稀释至刻度 1.0 6 6.0 稀释至刻度 1.2 取干净试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，1-6号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加入双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。 二、样液的测定 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管内，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm吸光度。 三、数据记录和处理 根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出位知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。 实验五??? 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的??? 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、原理??? 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。??? 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。三、器材1．乳钵???2．150mL锥形瓶??? 3．水浴??? 4．量筒??? 5．布氏漏斗及抽滤瓶?? 6．吸管???7．滴管??? 8．试管及试管架??9．烧杯???10．离心机??? 11．漏斗四、试剂和材料1．0．04 mol／L氢氧化钠溶液?????????? 1000 mL2．酸性乙醇溶液??????????????????????? 500mL将0．3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。3．95％乙醇??????????????????????????? 1000mL4．乙醚???????????????????????????????? 500 mL5．1．5 mol／L硫酸溶液???????????????? 200mL6．浓氨水????????????????????????????? 50 mL7．0．1 mol／L硝酸银溶液????????????? ? 50mL8．氯化铁浓盐酸溶液?????????????????? 80mL将2mLl0％三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。9．苔黑酚乙醇溶液??????????????????? 10 mL溶解6g苔黑酚于100mL 95％乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。10．定磷试剂?????????????????????????? 50mL（1）17％硫酸溶液? 将17 mL浓硫酸(比重1．84)缓缓加入到83mL水中。（2）2．5％钼酸铵溶液? 将2．5g钼酸铵溶于100mL水中。（3）10％抗坏血酸溶液? 10 g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17％硫酸溶液:2.5％钼酸铵溶液:10％抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(V／V)。11．酵母粉??? 200 g五、操作 将15g酵母悬浮于90 mL 0.04 mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3 000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。 取200ng提取的核酸，加入1.5 mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。1．嘌呤碱? 取水解液1 mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 0.1 mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。2．核糖