分子生物学（杨建雄）6.DNA的重组和克隆.pptVIP

（1） mRNA的制备 制备mRNA的常用方法是先制备总RNA，经oligo(dT)纤维素柱层析，用高盐缓冲液洗去其它RNA，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱并收集被特异地吸附在柱上的mRNA。对于高丰度的mRNA来说，合成和克隆cDNA之前无需进一步纯化特定的mRNA，而要得到低丰度尤其是极低丰度mRNA的拷贝，就要构建足够大的cDNA文库，或者通过分级分离富集目的mRNA来减少耗资可观、工作量大的建库和筛选工作。要获得高质量的mRNA必须创造一个无RNA酶的环境，在RNA的提取过程中，任何与RNA接触的器皿和溶液都必须做去RNA酶的处理，全部操作过程中都要戴一次性手套并经常更换。 （2） cDNA第一链的合成 来自禽成髓病毒和鼠白血病病毒的逆转录酶均可用于cDNA第一链的合成，前者具RNA酶H活性，最适温度42℃，较高的反应温度可消除mRNA二级结构对逆转录的阻碍作用，但RNA酶H活力会抑制cDNA的合成，限制其长度。后者RNA酶H活力较低，可得2～3kb mRNA的全长cDNA，但要用氢氧化甲基汞破坏mRNA的二级结构，在合成cDNA第一链时，用过量的巯基试剂使氢氧化甲基汞从RNA上解离。用12～18b的oligo(dT)为引物合成cDNA的效率较高，但得到＞3kb的全长cDNA较困难，6b的oligo(dT)为引物可得到较长的cDNA。 （3） cDNA第二链的合成 在反应体系中加入RNA酶H，切割cDNA/mRNA杂交体中的mRNA造成切口和缺口。产生的RNA片段可以作为cDNA第二链合成的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I作用下，合成cDNA第二链，用大肠杆菌DNA连接酶(该酶需要NAD+)封闭切口。再加入T4DNA聚合酶处理，其3→5外切酶活性去除单链3-突出端，聚合酶活性填补3-羟基凹端，产生可与接头相连的末端。 Decades of advances by thousands of scientists working in genetics, biochemistry, cell biology, and physical chemistry came together in the laboratories of Paul Berg, Herbert Boyer, and Stanley Cohen to yield techniques for locating, isolating, preparing, and studying small segments of DNA derived from much larger chromosomes. Techniques for DNA cloning paved the way to the modern fields of genomics and proteomics, the study of genes and proteins on the scale of whole cells and organisms. These new methods are transforming basic research, agriculture, medicine, ecology, forensics, and many other fields, while occasionally presenting society with difficult choices and ethical dilemmas. 1980 年诺贝尔化学奖：DNA重组技术 6.7.1 用于DNA克隆的工具酶 　　DNA克隆中使用的工具酶主要是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，此外还有DNA聚合酶、逆转录酶和用于修饰末端的酶，本节主要介绍限制性核酸内切酶，并概要介绍其它酶在DNA克隆中的作用。 限制酶的概念 　　1962年发现很多细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别和分解外来的核酸，以保护和维持自身遗传物质的稳定。细胞自身核酸由于特定序列上的碱基被修饰，最常见的是甲基化，从而避免了被内切酶水解。这样细胞就构成了限制-修饰体系，其功能是限制外来的DNA，保护自身的DNA。限制-修饰体系中的核酸内切酶就被称作限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，或简称为限制酶(restriction enzyme)。 限制酶的命名 　　限制酶按其来源命名，取来源菌种属名的第一个字母大写，种名的头两个字母小写，组成三个斜体字母，如有菌株名，再加上一个字母，其后再按该菌株中发现限制酶的先后次序，写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae