【2017年整理】CD133(+) 的胶质瘤细胞在3D壳聚糖-藻酸盐支架上的增殖与富集.doc

CD133(+) 的胶质瘤干细胞在3D壳聚糖-藻酸盐支架上的增殖与富集 Kievit, Forrest M; Florczyk, Stephen J; Leung, Matthew C; Wang, Kui; Wu, Jennifer D; Silber, John R; Ellenbogen, Richard G; Lee, Jerry S H; Zhang, Miqin 作者单位：神经外科，华盛顿大学，美国西雅图。 科学与工程材料，华盛顿大学，美国西雅图。 摘要：大量数据显示，肿瘤干细胞是人类肿瘤临床特性的原始决定因素，这为新一代抗肿瘤疗法提供了新的思路。但是，肿瘤干细胞难以在体外培养，这严重限制了对肿瘤干细胞的生物研究以及药物开发。本篇文章我们报道了从胶质瘤（GBM）细胞系中来源的增殖细胞在3D壳聚糖-藻酸盐支架（CA）上生长，能够显著提高那些表达CSC标记物的细胞的增殖和富集。我们发现与在普通培养条件下生长的细胞相比，CA支架生长的细胞在裸鼠接种时更具致瘤性，同时，细胞在支架上生长后，一些提示与CSC起源有关的上皮-间叶转化相关基因的表达迅速上升。我们的实验结果表明CA支架能够成为一种简单经济的体外培养CSC的支撑物，这将有助于我们更好的理解CSC的生物学特性，并发现更有效的抗肿瘤疗法。 1.简述 干细胞（CSCs）是肿瘤细胞中很小的一个细胞亚群，具有自我更新和无限增殖的能力，能够让肿瘤细胞向不同方向分化1-4。与肿瘤中的大部分细胞相比，CSC具有更强的侵袭性，转移潜能及对抗癌疗法的抵抗，这证明CSC更有可能是原发肿瘤的病因。这些发现表明CSC是肿瘤临床特征的原始决定因素，这为发现更有效的的治疗提供了目标。根据现有的肿瘤生物学理论，那些能够完全根除CSC细胞群的药物治疗肿瘤的效果更好。将CSC移除后，剩余的肿瘤细胞对传统的化疗很敏感5。然而，由于CSC细胞在肿瘤组织和单层培养的细胞系中所占比例很小（通常小于1%），因此在体外很难分离和富集CSC细胞，这为研究专门针对CSC的药物设置了很大的障碍6。 分离CSC的最常用的方法是流式分选（FACS）以及免疫磁珠分选（MACS），这两种方法利用抗体（比如CD133，prominin-1）与细胞表面的标记物结合进行分选6。这种方法需要昂贵的抗体和专用的仪器，但是只能得到少数的可以增殖的细胞。CSC同样能够通过体外无血清的特定培养基进行成球培养得到4，但是，神经球的生长缓慢，并且要消耗大量昂贵的特定的培养基，而且常常因为原代中CSC比例太小而失败4。细胞培养困难的一个重要限制就是没有应用三维环境（3D），3D培养为CSC提供细胞外基质，与CSC互相作用，能够促进增殖和提高恶性层度7，8。尽管之前有人用软琼脂或微胶珠的方法进行细胞分离培养，但是由于细胞密度太高和聚合胶的孔过小，细胞的收集以及后续的细胞实验难以进行。 目前，我们在CA支架上进行3D培养的胶质瘤细胞（GBM）和肝癌细胞经裸鼠致瘤实验证明，这些细胞比单层培养的细胞恶性程度更高。我们认为这些细胞恶性程度变高的原因，是由于CA支架的存在能够模拟体内的肿瘤巢10，11。这一结论与“肿瘤微环境对CSC的自我更新的保持具有重要的影响”相符12，之前我们曾报道过CA支架能够支持人类胚胎干细胞的生长13，这里，我们致力于说明CA支架能够提高GBM细胞系中干细胞的增殖与富集。我们用CD133流式细胞检测和免疫荧光的方法评价细胞的富集，并用PCR方法检测GBM干细胞相关基因来进一步测试CSC生长动力学，最后通过裸鼠接种进行再验证。 材料和方法 2.1.细胞株和组织培养 人胶质瘤细胞U-87MG和U-118MG由MTCC购得，以MEM培养基培养（内含10% FBS和1% 双抗，37℃ ， 5% CO2恒温培养），CD133及FITC由Abcam购得。 2.2.CA支架 2.3.细胞在支架上种植 将细胞种在12孔板内，每孔50，000个细胞/1个CA支架，50ul体系，让细胞贴壁1小时后，向每孔中加入1ml培养基。另分别设PCL/PS支架对照组，按说明书操作。2D培养对照组，将 1ml含50，000个细胞的培养基在12孔板中培养，每2天换液。 2.4.细胞增殖实验 Alamar Blue法。 2.5.电子显微镜成像 2.6.流式细胞分析 将细胞用Versene从支架上洗下来，加进FACS缓冲液（FACS buffer，含2%FBS的D-PBS），细胞密度为106/ml，一抗（1：50）冰孵1小时，FACS buffer洗三遍，二抗（1：1000）冰孵30min，FACS buffer洗三遍。用仅经过二抗染色的细胞作为空白对照。 2.7.免疫组化 2.8.PCR 2.9.致瘤实验 细胞在支架上培养15天后，用ver