植物组织中游离氨基酸总量的测定.doc

7．植物组织中游离氨基酸总量的测定 -----茚三酮显色法 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以，测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。 一、原理 氨基酸与茚三酮共热时，能定量地生成二酮茚胺。该产物显示蓝紫色，称为 Ruhemans 紫。其吸收峰在 570 nm ，而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。氨基酸与茚三酮的反应分两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成 CO 2 、 NH 3 和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺（ Ruhemans 紫），反应式如下： ? ? 在一定范围内，反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，因此，可用分光光度法测定其含量。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 各种植物组织。 （二）试剂 1. 水合茚三酮试剂：称取 0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中，加入 15 mL 正丙醇，搅拌使其溶解。再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇，最后加入 9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置 4 ℃下保存备用， 10 d 内有效。 2. 乙酸–乙酸钠缓冲液（ pH 5.4 ）：称取乙酸钠 54.4 g 加入 100 mL 无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至 60 mL 左右。冷却后转入 100 mL 容量瓶中加 30 mL 冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至 100 mL 。 3. 标准氨基酸：称取 80 ℃下烘干的亮氨酸 46.8 mg ，溶于少量 10 ％异丙醇中，用 10 ％异丙醇定容至 100 mL 。取该溶液 5 mL ，用蒸馏水稀释至 50 mL ，即为含氨基氮 5 μ g/mL 的标准氨基酸溶液。 4. 0.1 ％抗坏血酸：称取 50 mg 抗坏血酸，溶于 50 mL 无氨蒸馏水中，随配随用。 5. 10 ％乙酸。 （三）仪器设备 分光光度计，分析天平，研钵，容量瓶，试管，移液管，水浴锅，三角瓶，漏斗。 三、实验步骤 1. 样品制备 取新鲜植物样品，洗净、擦干并剪碎、混匀后，迅速称取 0.5 ～ 1.0 g ，于研钵中加入 5 mL 10 ％乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至 100 mL 。混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。 2. 制作标准曲线 取 6 支 20 mL 刻度试管，按表 27 – 1 操作。 ? 表 27-1 制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 标准氨基酸（ mL ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水（ mL ） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮（ mL ） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸（ mL ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 每管含氮量（ μ g ） 0 1 2 3 4 5 加完试剂后混匀，盖上大小合适的玻璃球，置沸水中加热 15 min ，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，当呈现蓝紫色时，用 60 ％乙醇定容至 20 mL 。混匀后用 1 cm 光径比色皿在 570 nm 波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以含氮量为横坐标，绘制标准曲线。 3. 样品测定 吸取样品滤液 1.0 mL ，放入 20 mL 干燥试管中，加无氨蒸馏水 1.0 mL ，其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查得含氮量。 四、结果计算 按下式计算样品中氨基态氮的含量。 式中： C ——从标准曲线上查得的氨基态氮含量， μg 。 V T ——样品稀释总体积， mL 、 V S ——测定时样品体积， mL、W ——样品鲜重， g 。 [ 思考题 ] 1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物颜色都相同吗 ? 为什么 ? 2. 抗坏血酸在测定中的作用是什么 ? ? 【 附注 】 1. 茚三酮重结晶的方法 合格的茚三酮应该是微黄色结晶，若保管不当，颜色加深或变成微红色，必须重结晶后方可使用。其方法如下： 5 g 茚三酮溶于 15 mL 热蒸馏水中，加入 0.25 g 活性炭，轻轻摇动，溶液太稠时，可适量加水， 30 min 后用滤纸过滤，滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出，用干滤纸过滤，再用 1 mL 蒸馏水洗结晶一次，置于