ELISA方法在基础医学研究中应用.docVIP

ELISA方法在基础医学研究中的应用 来源： 　　1. ELISA的基本原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术，几乎所有的可溶性抗原一抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平。该方法的基本原理如下：(1)将抗原或抗体结合到某种固相载体(目前以聚苯乙烯微量滴定板最为常用)表面，并保持其免疫活性。 　　此步骤称为“固相载体的包被”，在商品化试剂盒中均已完成。(2)再将抗原或抗体与某种酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)连接成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。检测时，按相应顺序加入待检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或酶标抗体，使其与固相载体上的抗原或抗体发生反应。以洗涤的方法洗去各步骤中过量的未结合物质，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。(3)最后加入酶反应的底物，底物即被酶催化生成有色产物，而有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定量分析。此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 　　2. ELISA技术在临床医学研究中的应用ELISA步骤复杂，试剂制备困难，只有应用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。目前应用较广的检测项目一般均有试剂盒出售，完整的ELISA试剂盒应包含已包被好的固相载体、酶结合物、底物和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。 　　在医学研究中，ELISA试剂检测的项目主要可分为以下几类：(1)各种病原体及其抗体的检测：如肝炎病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、疱疹病毒、艾滋病病毒等；(2)蛋白质：肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等；激素如HCG、FSH、TSH等；细胞因子如TNF．0l、VEGF、NFKB等；载脂蛋白如Apo A—I、ApoE等；(3)非肽类激素：如T3、rr4、雌二醇、皮质醇等；(4)检测血液中的药物浓度：如治疗心脏病的药物地高辛、抗癫痫药物茶碱、抗生素庆大霉素等 。 　　用于基础研究的标本来源多种多样，如临床血液标本，实验动物的血液标本，实验动物的组织标本，培养的细胞以及细胞培养上清等，均可作为待测样本用于检测其中某种物质的含量。具体应选取何种样本进行特定指标的检测，取决于实验研究的目的以及待测物质的表达特性。 　　3. ELISA在基础医学研究中的应用特点ELISA方法在基础研究中的应用与其在临床检验工作中具有很大不同，区别之处主要如下：(1)基础研究中ELISA检测所用标本来源广泛，涉及人、大鼠、小鼠、兔、猪、犬等多种常用实验动物种属的血液、组织、细胞及细胞培养上清液等，而临床检验所用标本则以人的血液(血清或血浆)和尿液等为主；(2)基础研究具有探索性，其结果也具有不确定性，没有正常值范围而言，需要根据ELISA检测指标的具体数值判断不同实验组间样品测定值的意义；而临床检验的ELISA检测结果具有阳性或阴性的界定，或者存在正常值范围作为判读测定结果的标准。(3)对于临床检验标本如血清和血浆而言，各种指标的ELISA检测试剂盒均会给出对待测样品的最佳稀释倍数；而在基础研究中，尤其当所测指标是在组织中表达时，即待测样品来源于组织时，ELISA检测试剂盒通常不会推荐对待测样品的稀释倍数；此时，研究者必须先通过预实验摸索出一个最佳稀释倍数之后再进行检测，因此，对组织样本的检测步骤较为复杂和繁琐。 　　4. ELISA的分类及主要操作流程ELISA方法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据样本中待测物质的种类及性质不同，可以设计出各种不同类型的检测方法。临床检验工作中用到的ELISA方法主要分为以下几种类型：(1)用于检测抗原的：双抗体夹心法和竞争法；(2)用于检测抗体的：双抗原夹心法、间接法、竞争法及捕获包被法等。然而，在基础医学研究中，涉及到的检测指标大多数为抗原性物质，因此，下文仅就双抗体夹心法和竞争法这两种测定抗原性物质的方法进行详细说明。 　　4．1 双抗体夹心法检测抗原研究表明，充血性心力衰竭患者循环及组织中自介素一6(inter—leukin-6，IL-6)升高，持续过度的IL-6产生会破坏细胞因子网络并可能导致心肌损伤及功能障碍的进展，因此，循环IL-6水平与左室功能障碍的严重程度密切相关。在此，以检测大鼠血浆IL-6为例说明双抗体夹心法的ELISA操作步骤和要点。 　　4．1．1 操作流程(1)取出试剂盒，置室温平衡30min；(2)按照说明书要求配制各种工作液：洗液、标准品稀释液及样品稀释液等；(3)根据说明书推荐的样品稀释度对待测样品进行稀释，同时按照说明书要求配制各浓度的标准