土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选论文.doc

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 及淀粉酶活力的测定 摘要 运用五点采样法从学校电子信息楼草地及竹苑餐厅旁边草地采集土样，通过涂布平板法和分区划线，结合单染色，从环境中分离纯化得到2，3，5，6，7号纯芽孢杆菌.并用淀粉平板鉴别培养筛选出纯产淀粉芽孢杆菌2，3，5号.通过一系列生理生化鉴定，结合伯杰式细菌手册,通过部分指标，初步推测2号菌为坚强芽孢杆菌，3号菌为嗜热脂肪芽孢杆菌，5号菌为巨大芽孢杆菌.37℃下淀粉培养基平板培养2—4d后采用碘液染色，观察是否有透明圈并测量计算透明圈直径(H)与茵落直径(C)的比值，初步确定所产淀粉酶酶活性大小得2号5号3号，后采用3，5一二硝基水杨酸显色法(DNS)对发酵培养基发酵培养提取的粗酶液进行酶活力测定，确定其产酶活性的大小，结果显示，5号菌株的酶活力最高；2,3,5号菌酶活依次分别为 0.318 U、2.483 U 和 3.488 U. 关键词 产淀粉芽孢杆菌;分离纯化;生理生化鉴定;酶活力测定 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样点的设计与样品的采集。于2010年5月13日在广大校园内根据土壤类型、种植植被类型及周围环境差异，随机采集0～20 cm种植层土样2个，每个样品由5 点混合而成，土样装入洁净塑料袋带回室内进行分离.采集结果分别为电子信息楼草地采集到较湿润的棕偏黄土样，同时于竹苑餐厅旁边草地采集到棕黄色湿润土样；周围植被均生长良好. 1.1.2 培养基。筛选培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、蒸馏水1000mL、pH7．0~7．2， 121℃灭菌20min，如用作固体培养基，则每升培养基中加入20g琼脂；种子培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3 g、NaC 5g、可溶性淀粉 2g、蒸馏水1000mL，调pH为7．0—7．2，121℃灭菌20min；斜面培养基：可溶性淀粉10gKH2PO4 3.0 g、蛋白胨5 g、 (NH4)2S04 2.5 g、调pH为7.0~7.2，121℃，高压蒸汽灭菌20min；液体产酶培养基：同种子培养基；葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.5、蛋白胨0.5 、K2HPO4 0.2、校正pH 7.2～7.4；蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH 7.2～7.4；西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02、磷酸二氢铵0.1、磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5、琼脂2、溴麝香草酚蓝溶液4???酚红试剂、校正pH6.8；营养明胶培养基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.8~7.0；耐盐培养基（%）：蛋白胨1、牛肉膏0.3、琼脂1.5 ～2.0、蒸馏水、氯化钠5（7）加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4，加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化. 1.1.3 主要试剂和溶液的配制. 主要溶液的配制。0．5％可溶性淀粉溶液(测酶活当天现配)：称取可溶性淀粉O．500 g ，精确至0．001 g，用少量蒸馏水调成浆状物，在搅动下缓缓倾人沸水中，然后，以少许蒸馏水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热煮沸20min直至完全透明，冷却至室温，用20mLpH6．0的磷酸缓冲液定容至100mL；磷酸一柠檬酸缓冲液(pH6．0)：称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20) 45.23 g，柠檬酸(C6H8O7·H20)8.07 g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后应以酸度计调整pH值为6.0；原碘液(储存液)：称取0．5 g碘和5.0g碘化钾研磨溶于少量蒸馏水中，然后定容到100mL，贮于棕色瓶中备用.稀碘液(工作液)：取lmL原碘液用蒸馏水稀释100倍(每天制备一次).1％ 3，5～二硝基水杨酸试剂：精确称取1 g 3，5一二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol／L氢氧化钠溶液中．加入50 mLL蒸馏水，再加入30 g四水酒石酸钾钠(C4KNa06·4H20)，待溶解后用蒸馏水定容100mL，盖紧瓶塞，勿使CO2进入；反应终止液：0．1 mol/LH2SO4. 主要试剂的配制。革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液,香柏油、二甲苯; 吲哚试验：乙醚、吲哚试剂;V.P.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚， 1.1.4 仪器或其它用具。无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、三角瓶、烧杯、洗瓶、玻棒、试管、酒精灯、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸等；恒温摇床、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌箱、超净工作台、水浴箱、紫外灯照射箱、磁力搅拌器、玻璃珠、移液管、涂布器、显微镜 1.2. 方法 1.2.1 菌株的分离提纯。称取5g土样，放入各自装有45mL，按照10