谷氨酸脱羧酶论文固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究.doc

谷氨酸脱羧酶论文：固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究 【中文摘要】Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,简称GABA)是哺乳动物神经系统的一种神经递质抑制剂,对人体具有镇静安神、促进睡眠、改善免疫功能等作用,在食品和医药领域具有广泛的应用价值,由生物方法制备的GABA已被我国卫生部列为“新资源食品”。生物体内的GABA由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,简称GAD)催化谷氨酸脱羧生成,因此GAD是GABA生物制备的关键酶。为了提高GABA生物制备方法的效率和竞争力,本文以利用固定化GAD进行GABA的生物制备为目标,分别采用凝胶包埋法和金属螯合方法进行了GAD的固定化,考察了固定化条件对固定化酶性能的影响,优化了固定化条件,测定了所得固定化酶的底物亲和强度、最适催化条件和操作稳定性等关键性质,为利用固定化GAD进行GABA的生物制备创造了条件。具体研究内容如下：对聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,简称PVA)-海藻酸钠(sodium alginate,简称SA)固定化GAD的条件进行了研究。分别考察了PVA浓度和SA浓度对凝胶颗粒直径、机械强度以及固定化后酶活力保留的影响；PVA和SA比例对固定化后酶活力保留的影响；PVA-SA与GAD酶液比例对固定化酶催化活力和酶活回收率的影响；以及CaCl2浓度对固定化后GAD酶活力的影响。研究表明,当PVA浓度为9%,SA浓度为2.5%,PVA:SA (W/W)为70：30,PVA-SA:GAD(W/V)为6：1,CaCl2浓度为1%时能获得机械强度好,酶活回收率最高的固定化GAD凝胶颗粒。在上述优化的条件下,考察了固定化GAD的各项酶学性质,并与游离酶加以比较。同时,测定了固定化后GAD的表观动力学参数,评估了PVA-SA包埋法固定化GAD的操作稳定性。研究表明,GAD的最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适催化pH向碱性方向略有改变为pH4.8；热稳定性最强的温度为45℃,比游离酶高了10℃；酸碱稳定性最好的pH为5.2,在实验设定的pH范围内,固定化GAD的稳定性大大高于游离酶；Km为13.6 mmol/L;连续催化7次以后,固定化GAD酶活力仍然保持在初始值的87%左右,说明PVA-SA法制备的固定化GAD凝胶颗粒操作稳定性好,具有很好的应用前景。利用亲和层析介质Ni-NTA对GAD进行了固定化,并测定了固定化后的各项酶学性质,动力学参数,考察了其???作稳定性。Ni-NTA亲和固定化GAD的最佳投料浓度为0.6mg/mL;最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适pH向碱性方向略有改变为pH4.8；酸碱稳定性最强的pH为5.6,热稳定性最好的温度为35℃；Km值为34.4mmol/L;重复使用8次后,活力保持初始活力的75%。 【英文摘要】GAB A is an essential neurotransmitter inhibitor of mammal which has important medicinal value and has been named as “New resource food” by Ministry of Health. GAD is the key enzyme of synthesis of GABA in the organism, so it can be used for biosynthesis of GABA. In order to improve the efficiency and competitiveness of biosynthesis of GABA, in this work, we immobilized GAD in two different ways, and tried to find the best condition for immobilization of GAD. Finally, we studied the various properties of immobilized GAD including:optimum pH and temperature of immobilized GAD, kinetic constant, operation stability and so on, in order to synthetise GABA.Firstly, the optimum conditions for gel formation and GAD activity were studied, including:the effects of concentration of PVA and SA to diameter,