血清学实验指导..doc

PAGE  PAGE 10 实 验 目 录 实验一：0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液的制备 实验二：1%鸡红血球悬液的制备 实验三：禽流感血凝试验 实验四：禽流感血凝抑制试验 实验五：口蹄疫病毒3ABC-ELISA抗体检测技术 实验六：猪瘟病毒ELISA抗体检测技术 实验一 0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液的制备 一、目的要求 掌握磷酸盐缓冲液的制备方法，为后续的血清学检测奠定基础。 二、药械及耗材 电子天平，小电炉，药匙，1000ml烧杯，玻棒，500ml三角瓶（带棉塞），pH试纸； Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaCl、蒸馏水；1 N NaOH、1N HCl（滴管瓶塞）。 三、试验程序 配方：Na2HPO4.12H2O 2.9克 KH2PO4 0.3克 NaCl 8.0克 蒸馏水 1000ml 将上述成分称量在烧杯中，加热搅拌溶解，待完全溶解以后，调整pH值至7.4。然后分装在3个三角瓶中（每瓶大约330ml），加棉塞，橡皮筋捆扎，置高压灭菌器中121℃ 15min灭菌处理，备用。 实验二 1％鸡红血球悬液的制备 一、目的要求 掌握鸡红血球悬液的制备方法，为后续的血凝和血凝抑制试验奠定基础。 二、药械与耗材 公鸡，玻璃注射器（30ml），16＃大针头，5％柠檬酸钠；800型离心机，玻璃离心管（10ml），洗耳球，10ml移液管，2ml移液管，棉花；0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液。 三、试验程序 ※ 从心脏采集公鸡的抗凝血约25ml，平均分装3支离心管； ※ 作对称平衡以后，3000rpm离心10min，弃上清液，保留红血球泥； ※ 加入适量PBS，用乳头滴管轻轻地洗涤红血球，然后作对称平衡，3000rpm离心10min，弃上清液，保留红血球泥； ※ 重复上述操作2～3次，直至上清液清亮透明； ※ 用10ml移液管轻轻地吸去上清液弃之，保留红血球泥； ※ 用10ml移液管向三角瓶中加入49.5mlPBS，再用2ml移液管吸取0.5ml红血球泥，棉花擦去移液管外壁粘附的红血球。将0.5ml红血球泥放入49.5mlPBS中，混匀置于4℃冰箱备用。 实验三 禽流感血凝（HA）试验 一、目的要求 流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体结构，HA试验由此得名。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可???于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。 二、药械与耗材 磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50μL移液枪、25μL移液枪、微量振荡器。1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。 三、诊断试剂和待检样本 禽流感病毒血凝素分型抗原。 四、试验程序 ※ 在微量反应板的1~12孔均加入25μL PBS，换滴头。 ※ 吸取25μL病毒悬液加入第1孔，混匀。 ※ 从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃去，换滴头。 ※ 每孔再加入25μL PBS。 ※ 每孔均加入25μL 1%鸡细胞悬液（注：勿必将红细胞悬液摇匀）。 ※ 振荡混匀，在室温（20~25℃）下静置40分钟后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞将成为明显的钮扣状沉到孔底。 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。以使红细胞100%凝集的抗原最高稀释倍数作为血凝效价。  实验四 禽流感血凝抑制（HI）试验 一、目的要求 流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。 二、药械与耗材 磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50ul移液枪、25ul移液枪、微量振荡器。1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。 三、诊断试剂和待检样本 禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。 四、试验程序 根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4，即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256/4）。 ※ 在微量反应板的1～11孔加入25ulPBS，第12孔加入50μL PBS。 ※ 吸取25ul血清加入