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膜蛋白的提取与分离.
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膜蛋白的提取与分离
膜蛋白的分离
一、简介:1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出细胞膜由连续的脂类物质组成。1925年GorterGrendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积,提出:细胞膜是由双层脂分子组成。1935年DanielliDavson:从测定膜的表面张力得出细胞膜的三明治结构模型,即蛋白质-脂-蛋白质。1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出单位膜模型,将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度:2(暗)+3.5(亮)+2(暗)=7.5细胞质膜的主要功能概括如下:(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2)选择性的物质运输,包括代谢底物的输入与代谢产物的排除,其中伴随着能量的传递;(3)提供细胞识别位点,并完成细胞内外信息跨膜传递;(4)为多种酶提供结合位点,使酶促反应高效而有序地进行;(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂,而膜蛋白的种类繁多,多数膜蛋白分子数目较少,但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式,膜蛋白可分为两大类型:外在膜蛋白、内在膜蛋白。(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来,膜结构并不被破坏。(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密,一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。
附注:使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白,膜蛋白,到目前为止,仍然是蛋白组学的一个瓶颈,不管采用2-D技术也好,ICAT乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。
蛋白抽提谈及蛋白分离,我们想到:超速离心,盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多,不同的蛋白质由于结构和组成的差异,其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性,同时可选择不同的溶剂提取,分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白,核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等,最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,一般常用的有胆酸盐,CHAPS(一种离子去污剂),Emulgen和Lubrol等表面活性剂。1、分离膜蛋白的方法(原则性):1)先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(例如:michael11液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白)2)用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活,但如果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题.如果不是用于测序的,可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而,他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如triton X-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(5000Da)要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%,所以充分的膜蛋白的提取,无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的.第二种方法简单,可靠,但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液,在温度超过20度时,此溶液分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此
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