胰蛋白酶或抑制剂分离纯化综合.doc

实验 胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化 在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。 胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。pH＜3时，胰蛋白酶易变性。 PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。 重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。 实验（一）胰蛋白酶活性测定 [原理] 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。 本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下： N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。 本实验方法二采用以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活性。以酪蛋白为底物，主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内，酶的水解滤液在波长275nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收作对照，根据活力单位的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在275nm 处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。 [试剂和器材] 1、试剂 （1）1.0mmol/L BAEE底物溶液 （2）10mmol/L HCl （3）0.1mol/L、pH8.0硼酸盐缓冲液 （4）10mg/mＬ酪蛋白溶液 取酪蛋白1g，加13mL 0.1mol/L NaOH、蒸馏水40mL，置60℃水浴加热至溶解，放至室温后，加水稀释调pH至8.0并定容至100mL。 （5）5% 三氯乙酸溶液 （6）0.2mol/L盐酸溶液 （7）50μg/mL酪蛋白对照溶液 精确称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸5mg，用0.2mol/L盐酸定容至100mL。 （8）胰蛋白酶样液 2、器材 （1）恒温水浴 （2）紫外分光光度计 （3）离心机 （4）试管 [方法和步骤] 1、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）测定法： 取2个光程为1cm的带盖石英比色杯，分别加入25℃预热过的2.8mL 1.0mmol/L BAEE底物溶液。向一个比色杯内加入0.2mL10mmol/L HCl，作为空白，在波长253nm下调节仪器零点；向另一个比色杯中加入0.2mL待测酶液，立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜。若偏离此范围则要适当增减酶量。 以时间（t）为横坐标，光吸收值（ A253nm）为纵坐标作图，在直线部分任选一个时间间隔与相应的光吸收值变化（△A253nm），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位。 2、酪蛋白为底物测定法 （1）取3支试管，1～3编号。 取试管1，加入1.0mL 酶液，加用0.1mol/L、pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在水浴保温10min，精确加入40℃预热的10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混匀，立即置于40℃水浴中，准确反应30min后，加入5.0mL的5%三氯乙酸，迅速摇匀。 取试管2，加入1.0mL 酶液，加用0.1mol/L，pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在40℃水浴保温10min，精确加入5.0mL 5%三氯乙酸，摇匀，在40℃水浴保温30min后，再加10mg/m