核酸含量測定.pptVIP

生物仪器分析技术;实验目的;型号：GeneQuant pro 品牌：通用（GE） 产地：美国 波长校准：启动后自动进行 ;用 途;546nm——双缩脲法/lowry法（Folin-酚法 ） 双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成蓝紫色复合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。 lowry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 562nm——BCA法 在碱性条件下，蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物，其吸光值与蛋白浓度成正比。 595nm——考马斯亮兰法（Bradford法 ） 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比。 ;OD600 ——检测细菌培养液的浓度 利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。 测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD6003表明细菌已经饱和。 细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测。细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时，此时可以进行传代等研究。 ;;比色杯;;;参数设定 DNA Set-up Select 修改参数 Enter确认;设定空白 将空白溶液加入比色杯中 Set ref ;核酸含量和纯度测定 将待测核酸样品按照比例稀释后，加入比色杯中 DNA 或 enter;实验原理;Lambert-Beer 定律 ——光吸收基本定律　 ;在不同pH 溶液中，嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质含量时均应在固定的pH溶液中进行。;碱基的互变异构; 采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定： 在260nm 波长下，10mm光径的比色杯中，光密度为1.0的DNA或RNA溶液的浓度??50或40μg/ml 。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液在OD260nm的吸光度值，即可计算测出其中核酸的含量。;;OD230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、苯酚等，Tris，EDTA和其他缓冲液的盐在这个波长都有吸收； OD320 表示检测溶液的混浊度和其他干扰因子，纯样品OD320一般是0，若溶液盐浓度越高，OD320的数值也越高。 ;OD260/OD280的比值用于评估核酸样品的纯度 纯净的DNA OD260/OD280﹥1.8 纯净的RNA OD260/OD280﹥2.0 比较纯净的核酸样品 OD260/OD230 ﹥2.0 若有小分子及盐离子存在，如核苷酸、氨基酸、酚等 OD260/OD230 ﹤2.0;植物基因组DNA提取;1 取大豆粉100mg，加入700μl 65℃预热的GP1溶液，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次； 2 加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm 离心5min； 3 小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀； 4 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm 离心30s，弃掉废液； 5 向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm 离心30s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；;6 向吸附柱CB3中加入700μl 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 7 向吸附柱CB3中加入500μl 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液； 8 将吸附柱CB3放入收集管中， 12000rpm 离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 9 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min， 12000rpm 离心2min，将溶液收集到离心管中。 ;操作步骤