PCR技术(2010级硕士).ppt

PCR技术及应用;目 录;PCR 可以在2小时内把 特定的基因指数放大;;PCR技术的创建;二、PCR技术的发明—Kary Mullis 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上…… ;;PCR从构想成为现实 1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。 ;;;;94℃变性;94℃;三、PCR技术的改进和发展 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术，大大提高了PCR的效率。 ;Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus);72℃;三、PCR技术的改进和发展 1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化 1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。 ;Kary B. Mullis（1944－）;PCR仪的变迁;PCR技术的原理; ;;PCR技术的特点;1）不对称PCR 2) 反向PCR 3）多重PCR 4）锚定PCR 5）逆转录PCR 6）原位PCR 7) 荧光定量 PCR; 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限 制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制 性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;反向PCR (reverse PCR) ;已知序列;多重PCR（复合PCR）;电泳;DMD：人类肌营养不良基因;LP-PCR（Labelled primers);标记引物;锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）;cDNA;PCR固相分析法;原位ＰＣＲ;既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。;操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物;ＲＴ－ＰＣＲ;基因;琼脂糖凝胶电泳;荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。;荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) ;5’;5’;R;R;荧光定量PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分???更加快捷方便,无需跑胶 ;荧光定量PCR仪;PCR的应用领域;分子克隆（目的基因的获取和鉴定）;5’;PBS group; 围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR－缺失突变） ;临床基因诊断;遗传疾病的基因诊断 ;A;;;1：Marker 2：阳性模板 3：待测样品1 4：已确诊乙肝病人样品 5: 待测样品2 6: 待测样品3 7: