体内药物第三章生物样品与样品制备教程.ppt

第三章 生物样品与样品制备;【大纲要求】;第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存;一、种类、采集和制备;肝素的加入： 1ml血液/需要肝素0.1～0.2mg，通常不需准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（1～2滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后立即轻轻振摇即可。;;(二) 尿液 1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢过程和代谢类型 2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。 3、尿样的保存与处理： ;(三)唾液 1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2）减小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液－血浆分布比例的个体差异较小。 2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清液冻存或直接分析。 3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究，（3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接受 4、应用：（1）在TDM中的应用 根据S/P分类，S/P＜1.0表示药物在唾液中的浓度很低；S/P＝1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示药物显著转移到了唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低 （2）药代动力学参数的测定 ;组 织 （1）匀浆化法：组织→加入水或缓冲液→匀浆→上清液 （2）沉淀蛋白法：组织→加入蛋白沉淀剂→上清液 （3）水解：组织→加入酸或碱→加热使组织液化→上清液 （4）酶水解：组织→加入酶和缓冲液→加热使组织液化→上清液;头 发 优点：取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的检测 缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低、需要精密仪器;特点： 广谱性 积累性 稳定性 依时性 相关性 指纹性;头发洗涤;毛发样品的制备;二、生物样品的贮存与处理;第二节 生物样品的预处理与制???;一、预处理目的;二、样品制备时应考虑的问题;;三、样品的预处理技术;（二） 去除蛋白质;;（二） 去除蛋白质;（二） 去除蛋白质;;其他去除蛋白的一些方法 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 2、超滤法 3、酶水解法 4、加热法;（三） 分离、纯化与浓集;1、液－液提取法（LLE） ;关键要考虑三个方面的因素： （1）有机溶剂的特性 （2）有机溶剂相和水相的体积 （3）水相的pH值;选择溶剂应注意的问题： （1）了解药物与溶剂的化学结构及性质，根据相似相溶来选择 （2）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶 （3）沸点低、易挥发和浓缩 （4）要与水不相溶 （5）无毒、不易燃 （6）不易乳化 （7）具有较高的化学稳定性和惰性 （8）不影响检测;2、有机相和水相的体积：一般为1:1～1:2 3、水相的pH值：碱性药物→pHpKa+1～2 酸性药物→pH＜pKa+1～2 4、提取次数：往往进行的是一次萃取，个别情况下可以对分离出的含药有机相用一定的pH水进行反萃取（Back extraction);优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离 缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大的化合物的萃取效率低 总的流程图：;消除LLE中产生的乳化现象： 1、提取前在水相中加入适量的固体食盐 2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化 3、置于冰箱中快速冻凝破坏乳化层，再融化后离心来消除已产生的严重乳化现象;LLE的两种特殊萃取方法： 离子对提取法（Ion-pair extraction) 提取烷基法（Extractive alkylation）;碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等 酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵 提取溶剂：氯仿、二氯甲烷;2、固相萃取( Solid phase extraction, SPE) （1）原理 根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。 决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶剂分子间的分子间作用力;洗脱方式： （1）药物与固定相的亲和力杂质与固定相的亲和力－先被保留后解吸 （2）药物与固定相的亲和力杂质与固定相的亲和力－直接洗脱; 可弃性柱、操作步骤少、使用溶剂少、节省实验费用和时间;（2）SPE固相选择的原则－固定相与被测组分应具有相似的极性，含有被测组分的样品应使用极性相反的溶剂溶解后上柱，而用与被测组分相似极性的