研究简报Mn-SOD基因导入黄瓜的遗传转化体系.pdfVIP

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(8): 897–904 Mn-SOD基因导入黄瓜的遗传转化体系 范爱丽1,2　孙　艳1*　管清美1　梁　东1 (1西北农林科技大学园艺学院, 杨凌 712100; 2广西农业科学院蔬菜研究所, 南宁 530007) 关键词 黄瓜; Mn-SOD基因; 遗传转化 收稿日期: 2010-11-09 接受日期: 2011-05-03 国家自然科学基金(No资助项目 *通讯作者。E-mail: sunyanma64@ 黄瓜是我国栽培面积最大的喜温蔬菜之一。在 生产上, 高温干旱等环境胁迫因子严重危害黄瓜的 产量和品质, 甚至导致绝收。任安芝等[1]综述了SOD 与水分、盐分、低温和大气污染等逆境胁迫之间的 关系, 认为: 各种逆境胁迫引起的活性氧代谢平衡失 调、生物膜结构破坏是导致植物遭受逆境伤害的机 理之一。通过基因工程提高植物体内抗氧化酶活性 及增加抗氧化代谢的水平是增强植物抗逆性的有效 途径之一。关于SOD基因已在烟草[2-3]、小麦[4]、玉 米[5]、苜蓿[6-8]、马铃薯[9-10]、百合[11]和仙客来[12]等 植物中进行了遗传转化并开展了抗逆的相关研究。 Lee等[13]利用黄瓜作为生物反应器生产SOD化妆品, 得到3株转基因黄瓜株系, 且SOD的活性比非转基因 植株提高了3倍, 未报道SOD与黄瓜逆境的相关性。 然而, 目前黄瓜的遗传转化体系并不完善, 转化效率 较低, 转基因性状遗传稳定性差[14-15]。因此, 本研究 在优化黄瓜再生体系的基础上[16], 利用根癌农杆菌 将Mn-SOD基因导入黄瓜, 研究卡那霉素等因素对黄 瓜遗传转化的影响, 建立了高频稳定的转基因体系, 将为黄瓜种质资源创新和加速抗逆育种奠定基础。 植物材料: 两片子叶将要脱离种壳且子叶露出 部分为绿色的农城3号黄瓜无菌幼苗; 农杆菌菌株: EHA-105; 质粒(pDU96.2144): 由美国康奈尔大学L. Fuchigami教授惠赠, 质粒T-DNA区含CaMV35S启动 子所驱动的npt II基因、GUS基因和Mn-SOD基因。 无菌苗获得培养基: MS基本培养基中添加蔗糖 30 g/L; 琼脂7 g/L, pH5.8; 预培养培养基: MS+0.005 mg/L TDZ+0.05 mg/L IBA; 共培养的培养基: MS+0.005 mg/L TDZ+0.05 mg/L IBA+100 mg/L Kan (卡那霉素); 芽筛选 培养基: MS+0.005 mg/L TDZ+0.05 mg/L IBA+100 mg/L Kan+500 mg/L Cef(头孢霉素 ); LB液体培养基 : l0 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast extract, 10 g/L NaCl, pH7.0 (固体培养基加5%的琼脂); 农杆菌液体培养基: LB+50 mg/L Str (链霉素)+50 mg/L Kan, pH7.2 (固体培 养基加12.0 g/L的琼脂)。 外植体子叶节的获得: 无菌条件下, 对两片子 叶将要脱离种壳且子叶露出部分为绿色的黄瓜幼 苗, 纵切下胚轴, 去除顶芽, 保留1/3单片子叶。 农杆菌菌液的制备: 从-80 oC超低温冰箱中取 出携带质粒 pDU96.2144的EHA-105菌液, 在冰上缓 慢融化, 在无菌超净工作台用接种环沾取少量菌液, 在添加Kan 50 mg/L, Str 50 mg/L抗生素的LB固体培 养基上划线, 在28 oC倒置培养36~48 h有菌斑出现后, 从LB平板上挑取单菌落, 接种到含Kan 50 mg/L, Str 50 mg/L的LB液体培养基中(pH7.2), 于28 oC、200 r/min 振荡培养过夜; 取对数生长期菌液, 4 oC、5 000 r/min 离心5 min, 弃上清液, 取沉淀重新悬浮于10倍MS液体 培养基中(pH5.3), 振荡后稀释不同浓度作为浸染液。 黄瓜遗传转化的影响因素 Kan选择压的确定: 将无菌子叶节和幼苗分别 接种于含不同Kan浓度(0 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、 90 mg/L和110 mg/L)的培养基中, 观察外植体对Kan 的敏感性。每隔2周换一次培养基, 观察统计分化芽 数和幼苗生根状况。 Cef浓度对抑菌和芽分化的影响: 将无菌子叶 节经农杆菌菌液浸染5 min后接种于含不同Cef浓度 (0 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L和600 mg/L) 的培养基中。每隔2周换一次培养基, 观察抑菌情况 和芽