细胞冻存复苏传代转染.docxVIP

细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。细胞的冻存与复苏【实验用品】材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、酒精灯、水浴锅、CO2培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作台。试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。细胞的冻存依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。细胞的复苏准备水浴锅，调温度至38℃。打开离心机。用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。1500r/min离心4min，弃上清液。加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。按5*105个/ml的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养。24h后取出培养瓶，观察细胞生长状况。【注意事项】对数期的细胞增值能力强，冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能太低，最好控制在5*106-1*107个/ml，这样才能保证复苏成功。冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间。为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。【实验结果及分析】经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞24h左右可贴壁，48h后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能贴壁。细胞的传代培养【实验用品】材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞试剂：PBS液、DMEM培养基（含10%小牛血清）、0.25%胰蛋白酶消化液设备：25ml培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、C02培养箱【实验方案】贴壁细胞的传代培养用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。向瓶内加入适量的PBS液，轻轻摇动后倒掉。每25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，置于37℃的培养箱环境中。轻轻摇动培养瓶，在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，迅速将消化液吸出。加入PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心5-8min，去除上清。细胞计数，按照1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。悬浮细胞的传代将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。800-1000r/min离心5min，去除上清液。加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。【注意事项】消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时，应终止消化。因上皮样细胞彼此间连接较为紧密，其消化时的时间通常比成纤维细胞长。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进生存与增殖。在对细胞进行吹