核医学第8章受体的放射性配基结合研讨.ppt

（二）放射性配基的质量鉴定 1、放射化学纯度: 除新鲜产品外,存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在95％以上。 2、结合活性鉴定 3、比活度：受体结合分析的结果计算离不开准确的比活度数据。 三、受体放射分析的类型 （一）标记配基饱和法 1、单点饱和法：定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体-配基复合物的放射性计算受体结合容量（或结合位点数）。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出KD，误差也相对大些。 2、多点饱和法：一定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量（一般7-8个实验点），使受体的结合趋于饱和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力（RT、KD），结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大，工作量大。 （二）非标记配基饱和法 一定量的受体和标记配基，逐渐增加非标记配基（一般7－8个实验点），使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。 这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。 四、分析条件的选择 （一）标记配基浓度 试验类型不同，选用的标记配基浓度也有不同。单点饱和试验要求饱和量的标记配基。对于多点饱和试验，应尽可能覆盖饱和区及非饱和区，还应考虑最低一点有足够的放射性满足放射性测量统计上的要求，最高一点的浓度则往往要考虑配基的来源及价格。 （二）受体浓度 一般说在一定范围内受体结合位点随组织量的增加而增加，特异性结合量与组织浓度成线性关系。在线性范围内，较高受体浓度，有时可增加特异性结合与非特异性结合的比值，有人提出，受体浓度应选为约相当于KD值。在实践中，往往需要通过实验来确定受体浓度。 （三）温育温度与时间 温度是影响反应速率的重要因素。温度高，结合快，达到反应平衡时间短，温度低，反应终止时容易降温，减少分离过程中复合物的解离。另外，温度低对配基及受体的稳定性有利。不同受体结合系统的最佳温度和时间要经过试验选定。 对于饱和或竞争取代试验，应要求反应达到平衡，故温育时间应足够长以达到平衡状态。温育温度与平衡时间是紧密相关的，不同的受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、温育温度、配基及受体浓度的不同而不同。一般室温（22℃）操作比较方便。0℃温育平衡时间虽然长一些，但其结果之重复性更好。 （四）缓冲液 结合分析使用过多种缓冲液，如磷酸盐缓冲液，Tris-HCI缓冲液等，所选缓冲液应不干扰结合，并在较大范围内可稳定pH。一般说，结合分析的pH应处于生理范围，即pH=7-8。 钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同的影响。因此要根据具体目的决定选用与否。如果加入的受体蛋白量较少时，宜在缓冲液加入适量蛋白，使反应液内蛋白浓度为0.1mg-1mg/ml为好。 为了阻止肽类的降解，常在分析时加入各种肽酶抑制剂。但要视具体是哪种肽而定，以确保实际有效。因为有些蛋白酶抑制剂有抑制特异性结合的作用。 五、结合体与游离配基的分离 受体-配基结合分析主要是测定反应平衡时结合配基的量，求解受体的密度与平衡解离常数。反应一般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。 理论上，一经分离，反应的平衡就会被破坏，所以选择适当的分离方法和环境，使受体-配基复合物在分离过程中的解离减少到最低限度。低温是降低解离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。 常用的分离方法有离心法、滤膜法、吸附法、透析法、电泳法等。若复合物解离快，则只能选择快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温度等方面保持各样品管之间的一致性，以减少误差。 （一）抽滤法（滤膜法） 1、选用的滤膜材料：既能阻挡复合物又不要过多产生对 游离标记配基的非特异性吸附。常用的滤膜是玻璃纤维 滤膜。 2、影响因素 （1）复合物的解离：一般说，低温时解离较慢，故滤膜 及缓冲液应保存于低温。用冰冷缓冲液抽洗为好。 （2）负压：若为多头抽滤器，应注意各孔压力的均一性 （3）标记配基对滤膜的吸附：标记配基吸附于滤膜是抽 滤法非特异性结合的主要来源之一。也是抽滤法的主要 缺点，减少标记配基吸附于滤膜的方法有：①滤膜预先 用非标记配基浸泡；②如果是多肽或蛋白标记配基，用 1％白蛋白浸泡；③用一定量的淋洗液或保证一定淋洗次 数，充分淋洗。 （二）离心法 这也是常用方法之一，很多受体分析建立之初都用此法，离心法可以在复合物很少解离的状态下达到较好的分离效果，但非特异性较高。 （三