食品生物技术导论基因工程讲义.ppt

教学目标 1、了解基因工程的产生及发展 2、掌握基因工程的概念和特点 3、掌握基因工程的四大要素 4、掌握基因工程的原理和过程 5、了解基因工程在食品工业中的应用 第一节 基因工程概述 基因（gene）——生命的最大奥秘 1865 孟德尔的豌豆实验 1915年至1928年摩尔根的果蝇实验 进一步证实了孟德尔因子和孟德尔定律 两大重要发现： 基因是在染色体上， 遗传的基因链锁和互换定律。 即建立了作为摩尔根理论主要基础的基因学说。 1953年最伟大的模型 ——DNA双螺旋结构模型 提出的DNA右手双螺旋结构，在英国《自然》杂志上发表了论文并1962年获得诺贝尔奖。 提出了DNA的复制机制—即半保留复制。 DNA半保留复制 DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 2、基因工程概念(Gene engineering) 指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。 工具酶 目的基因（制备） 基因载体 基因受体 第二节 工具酶 I型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。 II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需Mg2+，适合基因工程。 III型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。 例如：流感嗜血菌d株 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d Hind Ⅲ （1）作用机制 限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的磷酸二酯键上催化切开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。 （2）酶切特点 识别双链DNA分子中4—8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的对称回文结构。 EcoRⅠ的切割位点 EcoRⅠ的识别序列 5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’ EcoRⅠ产生的5‘粘性末端 5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’ PstI产生的3‘粘性末端 5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’ 反应系统缓冲液 Tris-HCl 50mM pH 7.5 MgCl2 10mM 低盐酶： 0~50mM NaCl 0~150mM 中盐酶：100mM DTT/BSA 1mM 高盐酶：150mM Volume 20~100μL T,T 37℃，1~1.5h 1U核酸内切酶的活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1 μg标准DNA所需的酶量。 鉴定——凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动， 不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理同，均为分子筛效应。 使用特点：琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。 5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’ （1）DNA片段末端修饰 核酸外切酶：切成平整末端 末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端 碱性磷酸酶：将5’-P修饰成5’-OH，防止载体自我环化 （2）DNA片段加连杆后连接 人工合成连杆或衔接头 三、其他工具酶 DNA聚合酶：PCR扩增 T4多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸转移至