2-丙基戊酸和5-氮杂胞苷对ips细胞诱导率影响的设计书.doc

2-丙基戊酸和5-氮杂胞苷对ips细胞诱导率影响的设计书 第一部分 文献综述 1．ips细胞发展简介 1.1 ips细胞的诱导 1.1.1 iPS细胞的诞生 成熟的体细胞由分化的状态逆转到未分化状态的过程称之为细胞重编程，细胞重编程现象最早在核移植实验中被发现。细胞重编程的方法包括体细胞核移植、miRNA干扰细胞质重编程技术、多能干细胞和体细胞融合、多能细胞的提取物与体细胞共孵育等。其重编程过程包括染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复以及x染色体失活等。重编程后，体细胞核会忘却原先体细胞留下的记忆重新进人发育程序。Wilmut等H1及Cowan等都通过自己的实验诱导体细胞重编程成功。但是这些方法最大的缺点就是供卵缺乏、伦理道德及政府法规的限制等。因此科学家们努力寻求从法律、道德和伦理等方面更易被人们接受的体细胞核重编程的方法。 细胞核移植和干细胞这两个各自迷人的领域，在2006年发生了非常引人注目的碰撞。一些重大的发现为这次事件铺平了道路。正如两栖动物中一样，细胞核移植进入小鼠卵母细胞后表明体细胞核重编程成为多能肽。 2006年8月，通过对卵母细胞和胚胎干细胞中涉及细胞重编程的细胞因子的深入分析和研究，日本科学家Takahashi 和Yamanaka 研究小组将24 种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞，最终确定有4 种转录因子组合———Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 即可将成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells )iPS细胞。它的诞生仿佛给沉寂一时的国际干细胞研究打入了一剂强心剂[1]。 1.1.2导入ips细胞的外源转录因子 通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES 细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS 细胞)，这一方法被称为iPS 技术。 ips细胞除了不能生成胚胎以外，可以产生所有的细胞，如果用于医疗，那么理论上可以治愈所有疾病——凡是不好的组织都去除，替换为重新生长的正常组织。它的功能几乎可以和ES细胞自从ES细胞涉及道德伦理的问题以来iPS以其突破伦理障碍的面貌改变大家对干细胞的看法，无疑，iPS是伟大的发现，它让科学家们可以更深入地了解我们的细胞。也让干细胞从理论研究到临床应用的步伐加快了许多，直接将病人的成体细胞改造成干细胞， 比再培育一个小孩取干细胞更符合伦理道德要求，也突破了移植排斥的障碍。能生成iPS细,因此c-Myc和Klf4在iPS细胞产生的过程中同样重要。c-Myc是在人类癌细胞中发现的卟啉-原癌基因,尽管c-Myc可以提高iPS细胞克隆形成率,但其构建的嵌合体小鼠约20%发生了肿瘤。所以如果将iPS细胞用于临床治疗, c-Myc基因的转入必须慎重。Klf4即是抑癌基因又是原癌基因,一方面可以促进ES细胞的自我更新,另一方面在体细胞中强制表达可抑制DNA的复制,阻滞细胞周期于G1/S期,因此它在细胞增殖和分化之间起开关作用[3]。 1.2 iPS 细胞的表观遗传学 诱导得到的iPS 细胞以相应物种的ES细胞为参照标准，从分子、细胞和动物个体水平对其进行系统的检测。包括其多能性细胞特异的标志基因的表达情况，向3 个胚层分化的潜能和自我更新能力，此外还涉及外源基因的沉默，及iPS 明确的遗传背景。 1.2.1分子水平上 iPS 细胞中导入的外源基因表达水平要随着重编程的完成逐渐降低或沉默，内源的多能性基因表达激活，基因的选择以ES 细胞表达的特异性标志为参照。如通过RT-PCR 检测Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、SSEA1、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81 等基因的表达情况且此类基因在不同物种间的表达不完全相同，如小鼠的iPS 一般SSEA1呈阳性，SSEA3、SSEA4 呈阴性。而人的iPS 细胞则正好与之相反，SSEA1 为阴性，SSEA3 和SSEA4 为阳性。此外，为了明确iPS 细胞的永生化能力，还需检测其端粒酶活性。 1.2.2细胞水平 iPS 的多向分化潜能和体外自我更新的能力。所得到的iPS 细胞首先形态上要与ES 细胞相类似，具体表现为细胞呈集落样生长、集落致密且边缘整齐、细胞形态较小、核质比高、增殖迅速、倍增时间短、能够长期传代。iPS细胞经AP 染色鉴定，要求呈阳性，还需进行多种转录因子及细胞表面标志的免疫荧光染色及流式细胞技术的分选，如：Oct4、Nanog、SSEA1、SSEA3等。完全重编程的iPS 细胞应具有体外分化潜能，能够分化为各个胚层的不同类型的细胞，如外胚层的神经细胞、上皮细胞、软骨细胞等；中胚层的肌肉细胞、脂肪细胞等；内胚层的肝细胞、胰岛细胞等。此外，还需检测iPS 细胞的