全国流感监测的技术指南.doc

附件2： 流感监测实验技术操作规范 一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输 （一）流感临床标本的采集 病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的采集时间、质量及其保存和运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。 常用的采样液有以下三种：pH7.4～7.6的Hanks、Eagles或者DMEM培养基。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中可加入抗菌素，加入庆大霉素（终浓度为1mg/mL，Gibco, cat. no. 15750-078）和/或制霉菌素（终浓度为50U/mL）。加入抗菌素以后重新调节pH值至7.4，分装每个采样管3mL，-20℃冻存。常用采样方法有以下几种： 1. 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子平行于上颚插入鼻孔，旋转，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。 2. 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部。同样将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。 3. 鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用3～5mL采样液涮洗收集器3次。 此外，对于尸检组织，必要时采集尸检的肺组织标本进行病毒分离。 （二）临床标本运输 新鲜采集的临床标本应在4℃条件下48h内运送至流感监测网络实验室。未能48h内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h内能进行检测的可置于4℃保存，否则应置-70℃或以下保存。 冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h内能进行检测的可置于4℃保存，否则应置-70℃或以下保存。标本应避免反复冻融。 临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。 （三）临床标本处理 临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。若为带有聚丙烯纤维的拭子标本，应先将带有聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。 鼻咽抽取液：用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液可直接接种或低温保存。 组织标本的处理：取肺组织标本放至平皿中，用灭菌生理盐水清洗肺组织2～3遍，研磨成组织悬液，配置成10％～20％的组织悬液，2000rpm离心10min，加入抗菌素，取上清直接接种。 注：如原始采样液中未加入抗菌素，应在标本接种前补加，庆大霉素终浓度为10mg/mL，青/链霉素（终浓度:青霉素G 100U/mL,硫酸链霉素100μg/mL），混匀后置4℃过夜或作用2h后进行接种。 临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份用于鸡胚接种，一份用于MDCK细胞接种，一份保存待复核用。对于病毒分离阳性的原始标本-70℃至少保存6个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本随时按生物安全的有关规定处理。 （四）血清标本的采集、处理、运输和保存 血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清,单份血清不能用作诊断。急性期血样应尽早采集，可在采集病毒分离标本的同时采集，但不能晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2～4周采集。一般采集空腹血。 1. 取一根体积5mL以上，无菌的血清管做好标记，并进行登记。登记的内容包括：医院名称、患者姓名、性别、急性期（Acute，A）或是恢复期（Convalescence，C）、采样日期（年，月，日）。 2. 从患者手臂静脉采5mL血，放入准备好的上述血清管中。 3. 放置于室温数小时待血液完全凝固。 4. 1500～2000rpm离心10min，收集血清于无菌管中，做好标记。 5. 无菌条件下采集的血清可置4℃存放1周，非无菌条件下采集的或存放超过1周的血清需置-20℃或以下保存。应尽量避免反复冻融。 （五）流感病毒株的运输 需送国家流感中心实验室检测的流感毒株，在流感监测信息系统填写“流感毒株送检单”，提交并打印送检单，加盖单位公章。在冻存后，低温条件下，送至国家流感中心进行复核检测，运输时应遵守国家生物安全的有关规定。 1. 流感毒株的送检要求 （1）流感样病例标本 各网络实验室对所有血凝滴度≥1：16的流感毒株，同时分别上送国家流感中心和省级疾病预防控制中心，送检量每份不少于3mL。各网络实验室分离的毒株从标本采