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已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析 黄 钢 第三军医大学遗传教研室 2006.11.1. 一、如何获取已知目的基因的序列信息 先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（） 进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ 二、目的基因cDNA序列的获取方法 cDNA文库扫描 RT-PCR 人工合成 组织RNA的提取 在匀浆器中加工冷冻的组织 通过注射器加工冷冻的组织 在液氮中将组织研磨成粉末 在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍。 合适的RNA提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果 RNA提取两要素 忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），..... 总之尽量快速！ 尽量减少RNAase污染 RNase的危害主要集中在将RNA pellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。 注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。 长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀 如何确认RNA的质量 RNA的电泳图谱 检测RNA溶液的吸光度 保温试验 荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析 RT引物的选用 GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录； 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。 RT中提高合成全长cDNA的效率 消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板的正确配对。 选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶： Thermoscript、Superscript Ⅲ等，RT后建议进行RNase H消化处理。 锚定RT引物的选用：5–(T)25V N–3‘ 热启动RT 有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA 高保真DNA 多聚酶的选用 常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等 PCR过程中HotStart与Touchdown的使用 高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用 PCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq 5U 72 ℃保温20～30 min 两步变温法PCR 载体构建中的常见问题 利用单酶切位点将片段插入载体 双酶切中的问题 对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE位点或重叠延伸融合成全长cDNA 酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC 真核表达载体的选择 Promoter Conventional/Tissue-Specific/Inducible Poly (A) tail Kozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4 一个载体内的多基因表达 IRES系统 加linker直接融合表达 多个独立的表达 cassettes：优于共转染表达 SOE技术与基因人工合成及多基因融合 基因设计与人工合成中的密码子优化 DNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002) /dnaworks/ SOE：Spliced by overlapping extension 三、引物设计 引物设计的3条基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计注意事项 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。 5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突