实验二总糖和还原糖的测定课件.pptVIP

实验二 总糖和还原糖的测定 (3，5～二硝基水杨酸法) 《食品生物化学实验》课程 一、实验目的 掌握3，5～二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和还原糖含量的基本原理，学会处理721型或722型分光光度计出现的问题 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 本实验是利用3，5～二硝基水杨酸溶液（DNS法）与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。 三、实验步骤 1、葡萄糖标准曲线的制定 葡萄糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。 取7支25×250mm的试管，分别按下表加入试剂： 2、样品中总糖和还原糖含量的测定 （1）样品中还原糖的提取： 准确称取10g新鲜材料（或2g材料干样粉末），放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20min，过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，再定容至100ml。 （2）样品中总糖的水解提取： 准确称取10g新鲜材料（或1g材料干样粉末），放在锥形瓶中，加入10ml 6 mol?L-1 盐酸，15ml水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上述溶液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。 （3）样品中糖含量的测定：取7支25×250mm试管分别按下表加入试剂： 四、实验结果 在Excel绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。 以表格形式列出实验数据，取样品的OD520平均值用标准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。 五、讨论分析 1、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖包括哪些？ 2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？ 3、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？ 附：仪器和试剂 主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管，移液管等。 3,5-二硝基水杨酸试剂： 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml 10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。 将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温放置7-10天后使用。 6 mol?L-1 盐酸 10%氢氧化钠溶液 酚酞指示剂 碘～碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。 * * 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 3,5二硝基水杨酸(ml) 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 蒸馏水（ml） 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 相当于葡萄糖量(mg) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 葡萄糖标准液（ml） 6 5 4 3 2 1 0 管 号 将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。 OD 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 3,5二硝基水杨酸(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2 蒸馏水（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0 样品溶液（ml） 3 2 1 3 2 1 0 总糖 还原糖 空白 管 号 加完试剂后，与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。 测定用提取液体积（ml）×样品重量（g） 还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数 还原糖（mg?g-1）= 测定用提取液体积（ml）×样品重量（g） 样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数 总糖（mg?g-1）= 六、改进实验