天津大学生物化学06第六章——《酶学》幻灯片.pptVIP

第七节 酶的分离提纯及活力测定 一、酶的分离提纯 二、活力测定 一、酶的分离提纯(总) 1．目的 2．提纯 3．制备战略 1．目的 （1）研究酶的理化特性、鉴定酶 （2）生物试剂及用作药物（高纯度） 2．提纯 酶有两大类，胞外酶及胞内酶。 胞外酶易分离。如收集动物胰液即可分离出其中的各种蛋白酶及脂酶。 胞内酶存在于细胞内，必须破碎细胞才能进行分离。 3．制备战略(总) （1）选材 （2）破碎细胞 （3）抽提 （4）浓缩 （5）纯化 3．制备战略1 （1）选材：含量高，易于分离。 （2）破碎细胞：研磨，匀浆器，捣碎机。 （3）抽提：抽提时注意的因素：pH、温度、盐及蛋白酶等。一般在低温下，调节pH至等电点，用盐析（硫酸铵或氯化钠）或有机溶剂（乙醇、丙酮、异丙醇等）使酶沉淀。 酶是生物活性物质，一般在0—50C进行提纯。乙醇、丙酮等有机溶剂分级分离时必须在－150C—－200C进行，酶制品一般都应在－200C以下低温保存。 3．制备战略2 ： （4）浓缩：抽提液和发酵液中酶浓度一般都很低，所以，在纯化前要进行浓缩，常用的方法有： ①蒸发：高真空的条件下，大面积热空气接触，使水分在瞬时蒸发，而达到目的。由于水分蒸发时能带走热量，所以，只要真空条件好，受热并不强。 ②超过滤。 ③凝胶过滤。 ④冰冻浓缩。 ⑤其他：如聚乙二醇浓缩等。 3．制备战略3 ： （5）纯化：首先了解所需纯化酶的理化性质（溶解度、分子大小和解离特性），以及酶的稳定性等。判断所选方法与条件的适当性，控制操作条件。具体纯化方法有： ①根据分子大小：凝胶过滤、超滤、超离心等。 ②根据解离性质：离子交换、电泳、等电聚焦等。 ③根据溶解度：盐析、有机溶剂沉淀等。 ④酶与底物、辅助因子及抑制剂的专一性亲和作用，可采用亲和层析。 二、活力测定 1．酶活力与酶反应速度 2．酶的活力(activity)单位 3．酶的比活力(specific activity) 1．酶活力与酶反应速度1 从图中可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随时间延长，酶反应速度逐渐下降。研究酶反应速度，应研究酶促反应的初速度。因为此时反应速度是成直线上升。 产物的浓度 酶反应的速度曲线 斜率=浓度/时间 =v 酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化某一化学反应的反应速度来表示。酶反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示：V=[S]/t [P] t 1．酶活力与酶反应速度2 造成反应速度下降的原因： （1）底物浓度降低 （2）酶部分失活 （3）产物对酶抑制 （4）产物浓度增加加速了逆反应的进行 1．酶活力与酶反应速度3 测定产物增加量或底物减少量的常用的方法：化学滴定法、比色、比旋光、气体测压、测定紫外线吸收、电化学法、荧光测定以及同位素技术等。 在简单酶反应中，底物减少与产物增加的速度是相等的。但一般以测定产物为好。因为测定反应速度时，实验设计规定的底物浓度往往是过量的，反应时底物减少的量只占其总量的一个极小部分，测定时不易准确，而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，就可以准确测定。 2．酶的活力单位 酶的活力大小，也就是酶量的大小，用活力单位来度量。 1961年国际酶学会议提出，1个酶活力单位(IU)是指在特定条件下（250C，pH、底物浓度适当）在1分钟内能转化lumol底物的酶量。 这是一个统一的标准，但使用起来不如习惯用法。 3．酶的比活力 酶的比活力(specific activity) 的大小，也就是酶含量的多少，即每毫克酶蛋白所具有的酶活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg，蛋白质）来表示，对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶愈纯。 第八节 酶的应用(总) 酶不仅在生命活动中有着极为重要的意义，而且在工业、农业、医药及科学研究中也日益发挥着它的重要作用。 1．在医药方面 2．某些食品的添加物 3．固定化酶新技术 4．作为研究工具 1．在医药方面 为进一步识别某种疾病、认识某病发病原理提供理论基础。 如急性肝炎时，血清中谷氨酸丙酮酸转氨酶（谷丙转氨酶GTP）活性明显升高。 在心肌梗塞时，血清中谷氨酸草酰乙酸转氨酶（谷草转氨酶GOT）活性升高。 另外，有些酶可以直接作药用。如胃蛋白酶、胰蛋白酶可治疗消化不良。 目前许多新开发的酶，成为非常价值的治疗药。如t-pA（丝氨酸蛋白酶－组织纤维蛋白溶酶原）可用于特异性溶解血栓，它比链激酶、尿激酶作用效果好，应用价值高。 2．在食品工业、轻工业上 可作为某些食品的添加物: 如葡萄糖异构酶可用来制造果糖浆。 葡萄糖氧化酶则可用于除去罐头中残余的氧。 还有些酶作为轻工业产品的原料，如加酶洗涤剂等。 3．固定化酶新技术1