第15章核酸的物理化学性质和研究方法.ppt

一、核酸的水解 （一）碱水解 （二）酸水解 （三）酶水解 2、测定核酸和核苷酸的紫外吸收的意义 （1）测定核酸在细胞和组织中的分布 （2）测定核酸或嘌呤、嘧啶及其衍生物或核酸在纯溶液中的浓度。 （3）测定核酸或嘌呤、嘧啶及其衍生物在层析图谱上的位置。 3、DNA的变性后的理化特性 黏度降低:天然的线型DNA,长径比大,可达1:107,水溶液黏度很大,变性后,螺旋变成线团,黏度显著降低. 紫外吸收值增加, 沉降系数(S)增加 五、 核酸的核苷酸序列测定 （一）酶法 （二）化学法 其中酶法经不断改进，使用较广泛。 六、DNA微阵技术 DNA微阵或叫基因芯片（gene chip)是以硅、玻璃、微孔滤膜为材料作为承载基片，通过为加工技术，在其上固定密集的不同序列的DNA，在1cm2的芯片上排列的DNA片段常有数十、数百甚至数十万个。一次杂交可获得大量的杂交信息。微阵技术因具有检测快速、灵敏、获得的信息量大，近几年发展迅速。 （一）DNA芯片的类型 固定在芯片上的DNA可分为三类： （1）从不同生物中分离的基因、基因片段或其克隆产物。将这些基因按阵列固定在芯片上。 （2）cDNA或是从cDNA文库中分离到的部分表达序列，即表达序列标签（EST)，可用以检测基因的表达水平或基因组的表达谱。 （3）合成寡核苷酸，现可根据需要设计出寡核苷酸的序列，通过DNA合成仪自动化合成。用于芯片的寡核苷酸的长度一般为20~25聚体。 （二）DNA芯片的制作 以硅片、玻片或滤膜作为 DNA的承载基片，应先对基片进行特定处理，如有些基片经过处理后，使基片表面带有氨基、醛基或环氧基等活性基团。 3/-末端经修饰带有氨基的DNA（或寡核苷酸）通过与基片上的某些基团反应，共价结合到基片上。 将DNA固定在芯片上（即点阵制作）的方法有三种： 接触打印法 照相平版印刷法 喷墨法 接触打印法：将DNA溶于点样缓冲液，吸入加样针内，然后与芯片基质表面接触，使DNA溶液转移其上。 喷墨法：将DNA溶液置于带有喷头的压电装置内，在电流控制下，将DNA液体喷在基片上，然后经过清洗，再换另一种DNA溶液，进行新一轮喷射。 照相平版印刷法： （三）DNA芯片的应用 1、测定基因型、基因突变和多态性 2、DNA的重建测序 3、测定基因的表达谱 * 第15章核酸的物理化学性质和研究方法 核酸的水解 一般理化性质 核酸的紫外吸收性质 核酸结构的稳定性 核酸的变性 核酸的复性 核酸的分子杂交 二、核酸一般理化性质 1、为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，通常表现为酸性。 2、DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有机溶剂，用乙醇可以沉淀核酸。 3、DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。 4、RNA在碱性溶液中不稳定，DNA在碱溶液中稳定。 5、利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。 三、核酸的紫外吸收性质 1、核酸的碱基具有共扼双键，在240~290nm处有紫外吸收性质，最大吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）处。核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。 四、核酸的变性 （一）核酸变性是指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状，只涉及次级键的破坏。 1、DNA热变性： DNA的热变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度( Tm)。 Tm Tm 2、影响Tm的因素 （1）G-C的相对含量高Tm高,已知Tm,依据经验公式求G-C的含量或Tm值：（G+C）% =（Tm — 69.3）× 2.44 （2）溶液离子强度低的介质中，Tm较低。 （3）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。 （4）溶液的pH： pH高时,溶液中的OH可取代T的O与A形成化学键.所以pH大于11.3时DNA完全变性；pH低时,溶液中的H+可取代A的H与T形成化学键.所以低于5.0时DNA易脱嘌呤. （5）均质DNA（polyA-T）或（polyG-C)熔链温度发生在一个较小的范围内，异质DNA熔链温度发生在一个较宽的范围内。 （二）核酸的复性 1、变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。将热变性的DNA骤然降温，不能复性形成无规则线团，如缓慢降温，可以复性，叫退火。 2、影响复性速度的因素： （1）单链片段浓度,浓度越高,复性越快 （2）单链片段的大小,片段越大,扩散慢，错配频率高，复性越慢 （3）片段内重复序列的多少,片段内重复序列的多,复性快 （4）溶液一定的离子强度,能消除磷酸基