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用于重组抗体生产的细胞构建技术研究进展 摘要：构建生产细胞系是重组抗体产业化制备的第一步。目前国际上用于重组抗体生产的工程细胞系表达水平可达20-70 pg/cell/day。多种动物细胞根据其特性的不同，在抗体药物生产中有着不同的应用。近年来，工程细胞系构建技术的研究进展主要集中在以下三个方面：利用细胞工程技术提高宿主的生长、表达能力，新型载体功能元件和定点整合技术克服载体随机整合时发生的位置效应，以及应用流式细胞分选术和高通量筛选机器提高了重组细胞的筛选通量和效率。 关键词：重组抗体；细胞构建；载体元件；筛选策略 近年，随着宿主细胞遗传特性的改造，载体功能元件的优化，以及高通量克隆筛选技术的发展，国际上用于抗体生产的工程细胞系表达水平可达20~70 PCD(pg/cell/day)。业内完成稳定细胞系的构建时间也缩短至3~6个月[1]。生产细胞系的构建是重组抗体产业化制备的第一步。 作为抗体产业上游关键技术，如何快速、高效建立生产细胞系，是我国抗体产业发展中急需解决的共性问题[2]。 1用于抗体生产的工程细胞系构建流程 抗体分子具备四聚体糖蛋白的复杂分子结构，其胞外表达遵循着分泌蛋白的一般规律：全抗体分子的轻、重链各自翻译后，经折叠、组装，糖基化修饰后才具生物活性。通过对已上市抗体的临床研究发现，宿主细胞对重组抗体的翻译后修饰，直接影响到抗体药物的临床疗效和免疫原性[3] [4]。 在常用的异源蛋白表达系统中：大肠杆菌不适合表达全抗体分子，只能表达单链抗体或者抗体片段；酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物等由于缺乏翻译后修饰能力，其所表达的重组抗体与人天然抗体存在着显着的质量差异。只有哺乳动物细胞适宜人源抗体的表达。因此，目前已上市的治疗性抗体中，除了少数抗体片段（如：LucentisTM）外，均由哺乳动物细胞生产[5, 6]。 1.1 用于抗体药物生产的宿主细胞 哺乳动物细胞中，CHO、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、PerC.6、HEK293等均有用于重组抗体生产的实例（见表1）[6]，这其中CHO、NS0及sp2/0细胞由于具备相对成熟平台化开发技术，在重组抗体生产中应用较为广泛。不同动物细胞的生长、代谢特性、以及对重组抗体的表达、修饰能力均不相同。CHO、NS0,sp2/0可产生非人源的糖基化修饰。如：sp2/0生产的Cetuximab因含非人源α(1,3)半乳糖结构造成临床上出现过敏反应[7]等。 表1 用于表达抗体的宿主细胞特性与应用 Table1 the characteristics of various animal cells and cases in commercial antibody production 优点 缺点 在抗体生产中的应用[6] CHO DHFR– （ATCC CRL-9096） CHOK1 遗传背景清晰，产业化应用广泛。 非人源糖基化修饰（如：NeuGc型唾液酸，高甘露聚糖等） 上市抗体：AvastinTM, CampathTM, HerceptinTM, HumiraTM,RaptivaTM,RituxanTM, TMVectivbix?, XolairTM, ZevalinTM，TocillizumabTM等 NS0 ATCC-CRL-1827,-2695, -2696） 缺乏内源性谷氨酰胺合成酶，更适合GS筛选体系 培养过程需添加外源胆固醇；非人源糖基化修饰如：α(1,3)半乳糖结构 上市抗体：MylotargTM, SolirisTM, SynagiTMs, TysabrTMi,ZenapaxTM等 Sp2/0 ATCC CRL-2016） 能够无血清悬浮培养 非人源糖基化修饰：如α(1,3)半乳糖结构 上市抗体：ErbituxTM, RemicadeTM, ReoproTM, SimulectTM等 Murine Hybridomas 鼠杂交瘤技术成熟 多用于表达鼠源抗体 上市抗体：BexaarTM, OthocloneTM等 Perc 6（Crucell公司） 人源细胞，借助病毒载体可实现重组抗体的高表达。 需Crucell公司授权许可 14种候选药物处于临床研究阶段 ECo li 技术成熟，培养成本低 只适合表达抗体片段 上市抗体：LucentisTM GlycoFi （Merck公司） 均一的糖基化修饰，生产成本低 需Merck公司授权许可 能够表达糖基化高度均一的IgG HEK-293 （ATCC CRL-1573） 人源细胞，瞬时转染技术成熟 受培养规模、工艺路线所限，不适合产业化生产 适合快速制备mg级样品。 1.2工程细胞的概念与构建流程 用于抗体药物生产的工程细胞需具备以下特性：生长特性良好，无血清悬浮培养密度高（1~2×107cell/ml）