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流式细胞术的基本原理与应用简介

荧光补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差 补偿公式 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%。 RD1-X%FITC 补偿模型 PE-X%FITC 横平竖直 补偿调整的实验过程 样本准备:阴性样本,单阳性样本 调整:第一步:阴性样本调整所有PMT 第二步:单阳性样本调整补偿 自动调补偿 手动调补偿 判断标准:横平竖直 数据分析 数据显示方式:单参数直方图 二维散点图 二维等高线图 假三维图 三维图 列表模式 设门:在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群,并对其进行单参数或多参数分析。 单参数直方图 双参数点图 二维等高图 Pseudo 3D Plot 3D Plot 密度图 假三维图 三维图 设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率,平均荧光值,绝对数或抗体结合数 流式细胞术的应用 细胞生理学研究(细胞相对大小和颗粒性、胞内pH值检测、Ca2+流动性检测、膜电势检测、细胞活性检测、细胞活力的检测) 细胞膜表面标记 胞内标记 细胞周期分析 凋亡分析 CBA (Cytometric Bead Array) 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号,通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值,可将不需要的脉冲信号去除,这一设定值称为阈值。 * 流式细胞术的基本原理与应用简介 余琪琪 12-09-2011 流式细胞术 流式细胞术(Flow Cytometry)就是对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流式细胞仪工作原理示意图 流式细胞仪可提供的信息 物理信息:通过散射光信号反映 荧光信息:通过荧光信号反映 散射光信号的产生 488nm激光产生散射光 SSC FSC 前向角散射光信号(FSC) 侧向角散射光信号(SSC) 利用散射光信号对混合细胞分群 红细胞裂解的全血 荧光信号的产生 荧光信号的表示方法 双参数点图 单参数直方图 一个完整的流式实验流程 样品的准备 荧光标记的选择 对照设置 仪器条件的确定 数据分析 样品准备 血液或骨髓标本 体液、灌洗液、悬浮培养细胞 贴壁细胞 组织标本 单细胞悬液,浓度5?105?1 ?106/mL 样本流速的选择 高流速:一般用于定性分析,如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速:一般用于对分辨率要求较高的分析,如DNA分析。 (注:根据制备样本浓度随时调整流速) 荧光标记抗体的选择 尽量使用直标抗体 多色标记时应该增加各种抗体的用量或适当延长反应时间 根据流式细胞仪的类型及荧光素的光谱选择荧光抗体 根据检测物(抗原)表达量选择荧光染料 使用双标以上抗体需要做荧光补偿 流式细胞仪 型号:BD FACSCanto II 光学信号的产生: 激光(488nm,633nm) 光学信号的收集: 光学滤片 光电倍增管(PMT):将光信号转换成电信号 FACSCantoII的光学滤片 长通滤片 (Longpass,LP) 带通滤片 (Bandpass,BP) LP500 500/50 750-810nm 650-670nm FACSCantoII信号检测组件 常见荧光染料的发射波长 荧光强度:APCPEPE-Cy7FITC 每个通道只能选择一种荧光素 各个通道之间的荧光素可以随意搭配 搭配的荧光素之间的发射光谱重叠尽量小 对照设置 阴性对照 阳性对照 补偿对照 阴性对照 空白对照:即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的基础荧光域值 同型对照:即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白,通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2。 阳性对照 阳性对照:阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞(阳性细胞)进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性 补偿对照 补偿对照:多色荧光分析,进行荧光补偿

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