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库尔勒香梨内生菌的分离及拮抗菌筛选与鉴定 刘娅 许芳芳 杨丽 赵玉焕 李春艳 （石河子大学食品学院 新疆石河子，832000） 摘要：以新鲜的库尔勒香梨为原料，采用组织块培养法，经表面消毒、内生菌培养、划线分离，从香梨的不同组织部位分离到了内生细菌、内生酵母菌和内生放线菌；以导致香梨病害的致病菌为靶标，通过初筛和复筛，发现具有较好拮抗效果的菌株为酵母菌和细菌。 关键词：库尔勒香梨；内生菌；分离；拮抗菌；筛选 前言 内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，它存在于植物、动物、微生物中，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。梨是一种大众很喜爱的水果，而且具有美容营养的作用，但是对于它的贮藏一直未得到妥善的解决，虽然一直用物理化学保鲜，生物防治的方法，但是用内生菌进行保鲜的方法还未实施行。由于内生菌来自库尔勒香梨本身，所以对其损害小，研究和开发内生菌及研发制品日益成为食品保鲜和贮藏的热点。 本研究根据库尔勒香梨的特点，对其内生菌进行研究，进行分离纯化，筛选出纯的菌株，进而筛选出具有抑菌作用的内生菌。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种分离的样品来源 从市场上购买健康，完整的库尔勒香梨，要选取带果柄的香梨，放于保鲜袋内，于4℃下冰箱保存，尽快进行分离试验。 标靶菌：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，少孢根霉菌，链格孢霉菌。 1.1.2 培养基 (1) 真菌分离培养基：PDA一链霉素培养基：（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，链霉素50ug／mL，pH自然）。121℃灭菌20min。 (2) 放线菌分离培养基：高氏一号培养基：(可溶性淀粉（20g），KNO3（1g），K2HPO4（0.5g），MgSO4? 7H2O（0.5g），NaCl（0.05g），FeSO4? 7H2O（0.01g），琼脂 20g，水1000mL，pH=7.4-7.6)。121℃灭菌20min。 (3) 细菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基：（牛肉膏3g,蛋白胨8g，琼脂16g，水1000mL，pH自然）。121℃灭菌20min。 （4）液体培养基：各种分离培养基除去琼脂后的成分。 1.1.3 主要仪器设备 高压蒸汽灭菌锅，电子天平，摇床，血球计数板，电热恒温培养箱，微生物洁净工作台、容量瓶、三角瓶、烧杯、试管、量筒、玻棒、移液管、吸量管、试剂瓶、滤纸等。 1.1.4主要试剂 葡萄糖，琼脂，链霉素，酵母，可溶性淀粉 ，硫酸铵，磷酸，磷酸氢二钾，磷酸镁，氯化钠，碳酸钙，蒸馏水，KNO3，MgSO4? 7H2O，FeSO4? 7H2O 1.2方法 1.2.1 内生菌的分离纯化与鉴定 1.2.1.1 库尔勒香梨的表面消毒 (1)实验材料的选择 选择健康新鲜的库尔勒香梨，采集后放入保鲜袋内，这是保证分离得到的是香梨中的内生菌而不是病原菌的关键。在采集香梨后要及时进行处理，香梨中组织的死亡也会影响内生菌的分离。 （2）植物组织表面消毒 将采集的样本先在流水下冲洗，除去表面的泥土和灰尘，在室温下晾干。用灭过菌的滤纸吸干香梨表面的剩余水分。将香梨分三个部分进行检测(皮下组织，果肉，梨籽)； A,将皮按均匀的小片削下，将小片放入50%的乙醇中稍浸泡，之后置于75%的乙醇中30s，再置于1%的次氯酸钠溶液中浸泡3-5min，然后用无菌水冲洗3-5次； B, 然后将香梨的果肉与核分开，将果肉切成2cm的方块，然后再进行如上操作； C,将核也切成大约1cm左右的小块，在进行如上操作。 （3）表面消毒效果的检测： 无菌水检验法：将表面灭过菌的样本在5ml的无菌水中震荡，取清洗后的无菌水1ml涂布于分离培养基的培养皿上，20℃下培养2周，观察是否有真菌生长。 培养 将香梨的籽，皮，核，肉四部分切成长、宽都为0.5 cm，厚为0.2cm左右的小块将创伤面贴在培养基上培养，每个培养基上4-5块，待长出菌落。 1.2.1.2内生菌的分离纯化 用接种环挑取生长出的菌落，在对应的培养基上划线培养，进行多次划线直至分离出单菌落，分离培养条件如下： (1) PDA一链霉素培养基上的菌种在28℃恒温培养箱中培养。 （2）高氏一号培养基上的菌种在28℃恒温培养箱中培养。 （3）牛肉膏蛋白胨培养基上的菌种在37℃恒温培养箱中培养。 1.2.1.3 具有抑菌活性内生菌的初筛 五点法进行筛选：在无菌的培养基上操作，首先用接种环在中间点一点内生菌，在其周围2-3cm处点四滴标靶菌，这四种标靶菌为相同的菌种。 1.2.1.4 具有抑菌活性内生菌的复筛 筛选方法：滤纸片法 （1）用打孔器打相同大小的