欧洲药典蛋白含量测定方法.doc

《欧洲药典》中蛋白含量的测定方法 《欧洲药典》第7版2.5.33，USP1057Biotechnology-derived articles-Total protein assay。 EP2.5.33收录了7种检测方法，即扫描法、Lowry 法、Bradford 法、BCA法、Biuret 法、荧光法和氮分析法。 1.1???? 扫描法： 原理：依据蛋白质结构中含有芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），其在280nm处有吸光值。检测时，如果溶解蛋白质的溶剂也有高吸光度，则采用干扰对照液进行补偿消除。但如果干扰对照液吸光值也很高，则检测结果误差大。此外，低浓度蛋白质溶液会因蛋白质吸附至检测池上而影响浓度，后者可使用高浓度或用去离子去污剂处理样品。 待测品：蛋白质溶液浓度一般为0.2mg/mL~2 mg/mL。 对照品：选择合适的对照品，用溶解待测品蛋白质的溶剂配制，浓度与待测品溶液一致。 检测：检测过程中，将待测蛋白溶液、对照品溶液和干扰对照液保持在相同温度。使用石英比色皿检测280nm处吸光值，并使用规定的溶液进行补偿。溶液浓度应尽可能保持在适宜范围内以便获取准确结果。 光散射影响：样品引起的光散射会导致蛋白质检测结果准确度降低。如果蛋白质溶液中存在颗粒大小与检测波长（250nm到300nm）相当的颗粒，光散射将导致样品的吸光值大大增加。为了校正光散射引起的在280nm处的吸光值，则可检测待测样品在320nm、325 nm、330 nm、335 nm、340 nm和350 nm处的吸光值，以所得的吸光值对数值为纵坐标，以检测波长对数值为横坐标作图，并通过线性回归确定标准曲线，将曲线延伸到280nm，得到280nm处吸光值的对数，再通过反对数计算获得280nm处由光散射引起的吸光值。从检测的总吸光值中扣除光散射引起的吸光值即为样品吸光值。用0.2μm滤膜过滤或离心可减少光散射作用，特别是明显浑浊的蛋白溶液。 计算：应使用校正过的吸光值进行计算，按下列公式进行计算。 CU=CS?(AU/AS) 其中，CS为对照液浓度，AU、AS分别为单侧样品和对照液的校正后的吸光值。 1.2???? Lowry 法： 原理：此方法是依据蛋白质中的酪氨酸能将磷钼酸-钨酸混合物还原，还原后物质在750nm处有最大吸收值。室温下，其颜色在20~30min内最深，随后将随时间逐渐减弱。这个方法干扰物质较多，因此可使用沉淀法处理蛋白样品。多数的干扰物质产生较低颜色，一些去污剂可明显加深溶液颜色。可使用高盐沉淀法提纯蛋白。由于不同蛋白质的吸光强度不同，因此对照品应与待测品一致。如果有必要除去干扰物质，则应在样品制备前按下述的方法处理。干扰物质的作用也可通过稀释作用降低，前提是应保证样品溶度符合准确测定的浓度要求。 配制溶液和试剂的水至少为蒸馏水。 待测品：配制适当浓度的待测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。溶液的pH以10.0~10.5为宜。 对照液：用规定的缓冲液溶解适量的对照蛋白，并用同一种缓冲液稀释成不少于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为5μg/ml~100μg/ml。 空白液：使用配制待测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。 硫酸铜试剂：取100mg硫酸铜和0.2g酒石酸钠，用水溶解并稀释至50ml。取10g无水碳酸钠，用水溶解并稀释至50ml。缓慢将碳酸钠溶液倒入硫酸铜溶液中，混匀。24h内使用。 碱性铜试剂：取1体积硫酸铜试剂，2体积50g/L十二烷基硫酸钠溶液和1体积32g/L氢氧化钠溶液混合。室温下储存，2周内使用。 稀磷钼酸-钨酸试剂：取5ml磷钼酸-钨酸试剂和55ml水，混匀。储存在棕色瓶子中，室温保存。（注：USP中规定取10ml福林酚试剂和50ml水混合。） 检测：取1.0ml各对照品溶液、待测品溶液、空白对照液，加入1.0ml碱性铜试剂，混匀，静置10min。加入0.5ml稀磷钼酸-钨酸试剂，混匀，室温静置30min。检测其750nm处吸光值，并以空白对照液作为补偿。 计算：一般情况下，蛋白质浓度与其吸光值关系并不是线性的，但是如果做标准曲线的浓度范围足够小，则其曲线是线性的。以浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标作图，通过线性回归得出标准曲线。由标准曲线和待测蛋白样品的吸光值即可计算得到待测蛋白样品的浓度。 干扰物质：在检测前加入脱氧胆酸-三氯乙酸混合液，沉淀析出蛋白质，除去干扰物质。这种技术也可用于由稀溶液浓缩的蛋白质。具体操作流程如下：加1.5g/L的脱氧胆酸0.1ml值1ml待测样品溶液。漩涡振荡混匀，室温静置10min。加入720g/L三氯乙酸0.1ml并漩涡振荡混匀。3000g离心30min，倾析出上清液并用移液器除去剩余的溶液。用1ml碱性铜试剂复溶蛋白质沉淀。 1.3???? Bradford 法： 原理：该法是基于酸性蓝90