模拟生理条件下快速单囊泡融合对SNARE的需要情况.doc

trans-SNARE复合物参与了几乎所有已知的发生在细胞内部的融合反应，其作用为使囊泡膜上的v-SNAREs与靶膜上其互补物t-SNAREs结合。而融合过程中所需SNARE复合物的数量以及外加蛋白是否为胞内发生的膜快速融合所必需还不清楚。膜上携带突触的/ 内吞作用的v-SNAREs VAMP/小突触泡蛋白的单囊泡能与包含有突触的/ 内吞作用的t-SNAREs突触融合蛋白-SNAP25的二维的、有支持作用的磷脂双分子层迅速融合。当每个囊泡膜上外向型v-SNAREs的数量低于5-10时囊泡的融合速率明显下降，所以将其作为囊泡融合所需最低指标。从囊泡接触到融合这一过程所学要的时间与5-11个t-SNAREs完成融合的时间一致，与v-SNARE的需求量一致。 胞内蛋白质的运输——以及激素、神经传导物质等的分泌——依赖膜融合。细胞内的膜融合反应机制为囊泡上的的v-SNAREs与靶膜上的同源t-SNAREs结合形成四螺旋束（SNARE针），形成的四螺旋束使邻近的双分子层发生融合。在细胞中，SNAREs受到辅助蛋白的调节，有些辅助蛋白，如Sec1/Munc18样蛋白家族是真核生物膜融合过程中必需成分。当没有调节蛋白或多肽存在的情况时SNAREs是否能够单独促进膜融合仍有很大争议。而且膜融合过程中需要多少SNARE针也还不清楚。在体外研究单个囊泡从对接到融合的过程发现，在没有任何辅助蛋白存在的情况下，5-10个SNARE针能够介导快融合的发生。 在进行SNARE介导的膜融合研究中，再造的膜融合试验发挥着很重要的作用。让融化的双分子层形成小的单层囊泡（SUVs），然后用慢动力学方法将SNARE蛋白结合到SUVs膜上。如今已经能将单SUVs（膜上有synaptic/exocytic v-SNAREs VAMP/synaptobrevin）与二维的、支持的双分子层（SBLs）（膜上有synaptic/exocytic t-SNAREs syntaxin1-SNAP25）融合，并且该融合反应发生的时间在10-100ms到数秒之间。然而，t-SNARE的亚单位SNAP25却不是必需的，或其需要人工肽段的辅助，这就使得这些结论的生物关联变得更加模糊。本研究以及其他有关SNARE介导的膜融合的研究中，使用只有具催化酶存在的脂质双分子，该酶具有催化膜融合的活性。事实上，自然条件下的细胞膜上存在多种蛋白， 其浓度30,000 ~ 40,000/μm2 ，使膜融合的环境完全不同于体外融合，这就使得SNARE蛋白在介导磷脂双分子层融合的过程中，必须将无关蛋白排除。 为了更好的模拟体内融合的过程，我们对双分子层进行了处理：将PEG链连接到磷酸酰乙醇胺上，从而在双分子层表面形成高度约4nm的PEG多聚物刷。实验中使用摩尔浓度为5%的PEG，使膜表面多聚物链的浓度约为70,000/μm2，体积为60 ~70nm3 ，与细胞溶质中50~60kDa叠球状蛋白值一致。我们发现SNAP25的依赖性得到修复，但是仍存在快速融合现象。研究中，提前使用PEG刷为双分子层提供立体保护，保证配体受体反应顺利进行。PEG化的SUVs 是已知的最稳定的脂质体，由于其绝佳的生物相容性，在给药中作为“隐形脂质体”。PEG链同时也赋予了脂质双分子层其他的稳定性。含有PEG刷的SBLs 干燥后在空气中保存的时间多于1天 ，且再水化没有明显失去其完整性，仍具有原来流动性。另外，显微镜下观察PEG链使双分子层离盖玻片产生大约4nm，而这一距离能够显降低跨膜蛋白与潜在的、损害跨膜蛋白径向扩散的底物之间的反应。 结果 除了PEG刷，在SBL中加入荧光脂质也能加强SUV-SBL融合。实验时，光漂白处理后必须给予一个简单的荧光恢复，下调至SBL的衍射极限来保证SBL的连续性和流动性。 实验设计基于特定的微流体流动系统，在这个系统中荧光标记的v-SUVs以可控速率流动，浓度高于SBL，在荧光显微镜下定量测定人为稳态下膜融合速率。低囊泡浓度下，我们能够很好地观察单个囊泡与SBL接触、融合的过程，而不需要借助荧光显微镜从那些已经发生连接的囊泡中辨别囊泡，这大大方便了我们检测融合的绝对效率以及从接触到融合所需的时间。在普通的载玻片上做两组平行的微流体流动链，这时我们可以清楚地对比这两组不同的反应环境。小体积的微流体链（~1μL）的使用，使整个实验可以在最低的恒定的SUVs流速下进行。这一流速还有助于冲洗掉与膜结合松散的无特殊键的v-SUVs、维持一个恒定的v-SUV浓度以及促进分析。 在亲水玻璃基板上的微流体流动链中，通过对包含SUVs 的t-SNARE的温育来合成有支持作用的双分子层。 双分子层合成之后用大量的缓冲液冲洗并进行SBL的质量检测，然后在 脂质标准浓度为40—60 nM、恒定流速为2—3μL/m