槲皮素金属配合物的合成及清除自由基能力的研究设计性实验报告.doc

槲皮素-金属配合物的合成及清除自由基能力的研究 自由基是一类外层轨道含有未配对电子的原子团或特殊状态分子，其中与人体关系最为密切的是氧自由基，如超氧自由基(O-2·)、羟基自由基(·OH)、脂质过氧化自由基(ROO·)等，其中以O2-·形成最早，·OH氧化性最强。通常自由基在机体内的生成和去除处于动态平衡状态，不会对机体造成严重损伤，但是当机体对自由基的清除能力减弱或自由基清除剂供给不足，以及摄入生成自由基的物质过多时，体内的自由基相对过剩，会攻击生物大分子如蛋白质、核酸、脂质等，使其交联或断裂，进而破坏细胞的结构和功能，导致机体病变、衰老和死亡。随着氧自由基和抗氧化理论研究工作的深入，特别是一些合成的抗氧化剂在使用中存在一些毒性时，天然抗氧化剂的研究越来越受到人们的重视。 1、前言 黄酮类化合物(Flavonoids)是目前倍受关注的天然活性产物之一。槲皮素又名栎精(quercetin)，是一种黄酮醇类天然化合物，来源于芦丁的酸性水解产物，化学命名为3,5,7,3`,4`-五羟基黄酮(Que)，广泛存在于大约68%的植物中。分子式：C15H10O7；分子量：302.23；结构如下： 槲皮素广泛分布于蔬菜、水果、干果、饮料及中草药之中，槲皮素药理作用广泛,具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗氧自由基和抗心率失常等多种生物活性及药理作用。但由于槲皮素在水中溶解度低,极大地影响了槲皮素在生物体内的利用度。根据中药配位化学原理,中药有机成分与微量元素结合后往往会提高其生物活性或产生新的生物活性。作为金属螯合剂，黄酮类化合物在金属的生物可利用性方面起着重要的作用。将黄酮类化合物与人体必需金属元素形成配合物,并发挥其抗活性氧自由基的协同增效作用是较为全新的研究领域,为槲皮素的开发利用开辟了新的途径。本实验将合成的三种配合物[槲皮素铜(Ⅱ) 、槲皮素铁(Ⅱ)、槲皮素锌(Ⅱ)]与配 43 体，在Fenton反应机制产生羟自由基和光照核黄素产生过氧自由基的体系中进行了响应行为的比较和探讨。为槲皮素类新型药物的寻找和开发提供了实验基础。 2、材料与方法 试剂：槲皮素（上海化学试剂二厂，生化试剂）；邻苯三酚；维生素C，食品级；Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.2）；醋酸锌等试剂，除标明外，其余试剂均为分析纯；全部实验用水为二次蒸馏水。 仪器：磁力搅拌器、pHS-3C 数字酸度计、722型分光光度计 3、实验方法 3.1 配合物的合成 3.1.1 槲皮素-铜、铁、锌配合物的合成 按适宜的摩尔比(槲皮素与醋酸铜为2:1，槲皮素与醋酸锌、氯化铁均为1:1)，分别将金属盐溶液在搅拌下缓慢滴加到槲皮素溶液中。如：在不断搅拌下，按摩尔比为1:1将0.5mol/L的Zn(Ac)2乙醇溶液滴加到0.5mol/L的槲皮素乙醇溶液中，搅拌均匀。用5%NaOH乙醇溶液调节pH=9，水浴回流搅拌70min，产生沉淀物，静置冷却后过滤，3000r/min离心分离，沉淀用无水乙醇反复洗涤，以除去其中残留的柚皮苷和游离的金属离子，得到粗品。用丙酮与冰醋酸以1：1混合溶剂对粗品进行重结晶，析出浅黄色针状晶体，抽滤，45℃真空干燥。 3.2 抗氧化活性测定 3.2.1 槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定 产生HO·自由基的反应体系是Fenton反应： H2O2 + Fe2+ → OH- + HO· + Fe3+ 自由基一般存活时间比较短而且活性高，而水杨酸能有效捕捉HO·自由基且产生有色产物。因此，若在该体系加入一定量的水杨酸，将发生如下反应： 产生的有色物质在510nm处有强吸收。添加水杨酸后立即测定吸光度值(此值可作为A0)。若在水杨酸捕捉自由基的体系中添加黄酮类物质，由于黄酮类化合物具有清除HO·自由基活性，从而降低甚至完全清除HO·自由基，而使有色物质的浓度降低，在此条件下 44 测定吸光度值，则可用来测定黄酮类化合物对HO·自由基的清除效率。 在25mL比色管中依次加入2mmol/L FeSO4溶液3mL、1mmol/L H2O2溶液3mL，摇匀，再加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，加入蒸馏水补充至25mL，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度A0。另取25mL比色管依次加入2mmol/L FeSO4溶液3mL、1mmol/L H2O2溶液3mL，摇匀，分别加入1.0×10-4mol/L待测液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，于37℃水浴加热15min后取出，然后加入6mmol/L水杨酸溶液3mL，继续水浴加热15min，取出用蒸馏水补充至25