植物中SOD的分离提取及性质研究.doc

植物中SOD的分离提取及性质研究 前言： 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。 SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。 材料及方法： 一、试剂 (1) PH7.8 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液 (2) PH8.2 50mmol/l Tris-HCL (3)0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。 7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。 含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。 当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。 0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 I pH 0.2mol/L 0.2mol/L 5.8 8.0 92.0 6.0 12.3 87.7 6.2 18.5 81.5 6.4 26.5 73.5 6.6 37.5 62.5 6.8 49.0 51.0 7.0 61.0 39.0 7.2 72.0 28.0 7.4 81.0 19.0 7.6 87.0 13.0 7.8 91.5 8.5 8.0 94.7 5.3 附录II Tris-HCl缓冲溶液（0.05mol/L Tris 溶液和X mL 0.1mol/L HCl混匀后，加水稀释到100mL） pH X/mL pH X/mL pH X/mL 7.1 45.7 7.8 34.5 8.5 14.7 7.2 44.7 7.9 32.0 8.6 12.4 7.3 43.4 8.0 29.2 8.7 10.3 7.4 42.0 8.1 26.2 8.8 8.5 7.5 40.3 8.2 19.9 8.9 7.0 7.6 38.5 8.3 17.2 9.0 5.7 7.7 36.6 8.4 二.实验仪器 移液管、离心机5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等 三.实验内容 （1）大蒜粗酶液的提取 Ⅰ.提取：称20g左右的大蒜至于研钵(事先冷藏)中，充分研磨使细胞破碎，再加入5ml 0.05mol/l PH7.8的磷酸盐缓冲溶液(事先冷藏)，继续淹没搅拌15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000r/min，离心10min，弃去沉淀，得提取液。 Ⅱ.取出杂蛋白：提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min，5000r/min离心10min，取出杂蛋白，得粗酶液。 Ⅲ.沉淀SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，5000r/min离心10min，得SOD沉淀溶于2ml PH7.8的